辣木叶乙醇提取物对非酒精性脂肪肝小鼠模型血脂和氧化应激影响的研究

　　摘 要： 该研究以低剂量(5 mg·kg-1)、中剂量(30 mg·kg-1)和高剂量(60 mg·kg-1)的辣木叶乙醇提取物(EE-MO)干预高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠动物模型。结果表明：(1)高剂量的EE-MO显著降低NAFLD小鼠的体重和肝湿重;EE-MO剂量依赖性地降低NAFLD小鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量;高剂量的EE-MO除降低上述生化指标外，还显著降低血清中FFA含量。(2)HE和苏丹红Ⅲ染色发现，EE-MO处理后，模型组小鼠的肝脂肪病变和细胞损伤得到显著改善。(3)EE-MO对NAFLD小鼠模型的血脂代谢具有改善作用。(4)高脂饮食诱导小鼠肝脏和血清的ROS和MDA的含量，诱导SOD、POD和CAT活性增加，降低GSH-Px活性。(5)低剂量、中剂量和高剂量的EE-MO依赖性地降低NAFLD小鼠肝脏和血清的ROS和MDA的含量，缓解氧化胁迫。(6)低剂量的EE-MO对SOD、POD、CAT和GSH-Px酶活性无显著影响;中剂量和高剂量的EE-MO处理后，NAFLD小鼠的SOD、POD和CAT酶活性显著下降，GSH-Px活性显著增加;EE-MO可能通过GSH-Px抗氧化酶途径缓解NAFLD小鼠的氧化胁迫。

　　关键词： 辣木， 氧化应急， 非酒精性脂肪肝， 血脂

　　《烟台果树》(季刊)创刊于1980年，由烟台市农科院果树科学研究所主办。《烟台果树》发行量大(年发行16万册),覆盖面广,读者遍及全国各地。

　　辣木(Moringa oleifera)为辣木科辣木属植物，有“奇迹之树”的美称，是一种有独特经济价值的热带植物。辣木原产于印度，从20世纪开始，我国的云南、广东、广西、福建、贵州、台湾等省(区)开展了辣木引种种植和产业化开发研究。辣木浑身是宝，根皮是传统医药原料，嫩叶和嫩果是味道和营养都丰富的蔬菜，种子富含植物油，在国际市场上十分紧俏。

　　据测定，辣木的蛋白质含量为牛奶的2倍、钙为牛奶的4倍、钾为香蕉的2倍、铁为波菜的2倍、维生素C为柑桔的7倍、维生素A为胡萝卜的4倍、维生素E分别是螺旋藻和黄豆粉的70倍和40倍(刘昌芬和李国华，2004)。现代药理学的研究表明，辣木有退热、消炎、排石、利尿、降压、降血脂和抗氧化等功效。在印度和非洲国家辣木常用于治疗糖尿病、高血压、心血管病和肥胖症等(Anwar et al.， 2007; Fahey， 2005; Ghasi et al.， 2000;Song et al.，2017)。杨倩等(2017)发现，不同剂量的辣木水提取物能降低高脂膳食誘导的肥胖大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量。正常的SD大鼠喂食辣木叶粉后，血清中甘油三酯和胆固醇含量显著低于对照组(张幸怡等，2016)。

　　此外，辣木提取物还具有较好的抗氧化作用。体外研究发现，辣木叶乙醇提取物(ethanol extract of Moringa oleifera， EE-MO)对DPPH、ABTS和OH自由基的清除率与正对照BHT相似(周伟等，2017)。辣木茎叶中的水溶性多糖对羟自由基及超氧阴离子均有清除作用，且具有剂量依赖性(梁鹏和甄润英，2013)。在大鼠肾和心肌缺血再灌注模型中，辣木籽提取物能显著降低模型组动物血清的MDA含量，增加血清及肾或心脏中谷胱甘肽过氧化物酶活性，缓解氧化胁迫(曲震理， 2016; 曲震理等， 2017)。

　　非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展是一个缓慢的过程，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝纤维化和肝硬化，部分患者甚至可进展为肝细胞癌。近年來，随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，我国的NAFLD发病率明显上升且呈年轻化趋势，现在NAFLD已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。 NAFLD的发病机制尚未完全明确，目前认为主要与胰岛素抵抗(IR)、氧化应激、炎症作用、库普弗细胞与细胞因子、脂代谢紊乱和铁超载等相关(Loomba & Sanyala，2013)。其中，氧化应激和脂代谢紊乱在NAFLD肝细胞损伤过程中具有十分重要的作用。本文主要研究EE-MO对NAFLD小鼠模型血脂和氧化应激的影响，探索EE-MO在改善NAFLD症状方面的有效性，并揭示可能的机理，为辣木的进一步合理开发提供依据和参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 EE-MO的制备

　　辣木叶购于云南省昆明市螺蛳湾药材市场。称取2.5 kg干燥的辣木叶，粉碎后，加95%乙醇室温提取3次(每次为6 L，24 h)。合并提取液后，用旋转蒸发仪回收乙醇至无醇味。醇提物用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到干燥粉末状的醇提物。

　　1.2 动物实验和分组

　　共有55只SPF级小鼠，随机选取10只为正常对照组 (N-CK)，其余45只为模型组。参考钟岚等(2000)的方法复制脂肪肝大鼠模型，用88%普通饲料、10%猪油、2%胆固醇制成的混合饲料，经机器生产压制成条状，制成高脂饲料。正常组始终喂以普通饲料，模型组喂以高脂肪饲料。模型组从第5周开始从背部后侧注射40%的CCl4豆油溶液，正常组注射纯豆油溶液，注射剂量为2 μL·g-1，每周2次，共3周。

　　造模8周后，随机选择5只模型组小鼠处死，取出肝脏做病理切片，检查模型是否复制成功，确定成功后，从第8周开始，将模型组分为模型对照组(M-CK)、低剂量辣木叶处理组(D-LM)、中剂量辣木叶处理组(Z-LM)和高剂量辣木叶处理组(G-LM)。每天早上9：00，D-LM、Z-LM和G-LM处理组小鼠分别用5、30和60 mg·kg-1的辣木叶提取物灌胃，M-CK处理组给予等体积的生理盐水灌胃。处理期间，N-CK组小鼠继续用普通饲料喂养，所有模型组的小鼠用高脂饲料喂养。持续2周后，将所有小鼠处死，取其血液和肝脏组织，做后续生化指标和病理学检测。

　　1.3 血液和肝组织生理生化指标检测

　　TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA含量与ALT和AST活性均采用试剂盒测定。所有操作按照试剂盒说明进行。其中，TC和TG含量所用试剂盒购于上海生物工程技术有限公司。HDL-C、LDL-C和FFA含量所用试剂盒购于大连TAKARA公司。ALT和AST活性测定所用试剂盒购于中国上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。

　　1.4 抗氧化物酶活性测定

　　用氮蓝四唑法测定SOD酶活性，用愈创木酚法测定POD酶活性，用紫外速率法测定CAT酶活性，用分光光度计比色法测定GSH-Px活性。

　　1.5 MDA和ROS含量测定

　　脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸分光光度法测定，ROS含量采用Luminol化学发光法测定(Faulkner & Fridovich，1993)。

　　1.6 HE染色

　　将肝脏组织碎片放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液浸泡固定24 h，取出，用自来水冲洗4 h后，依次用50%、70%、80%、90%和100%乙醇浸泡脱水。将脱水后的标本用二甲苯浸泡2次(每次15 min)。用石蜡包埋后，进行切片。切片先依次放入二甲苯I和II进行浸泡脱蜡，然后用95%、85%、70%和50%的梯度酒精溶液中依次浸泡2 min蒸馏水冲洗2 min。标本经苏木素浸染5～15 min和1%伊红水浸染1～5 min，脱水，透明后进行镜检。

　　1.7 苏丹红Ⅲ染色

　　参照马羽萍等(2010)的方法。

　　2 结果与分析

　　2.1 EE-MO处理对NAFLD小鼠模型体重和肝湿重的影响

　　如表1所示，高脂饮食8周后，M-CK组小鼠的体重显著高于N-CK组。用低剂量的EE-MO干预2周后，小鼠体重与M-CK组相比无显著性差异。用中、 高剂量的EE-MO干预2周后， 小鼠的体重与M-CK组相比有下降的趋势，虽然Z-LM组小鼠的体重与M-CK组相比仍无显著性差异，但G-LM组小鼠体重显著低于M-CK组。肝湿重与体重的变化趋势类似，M-CK组小鼠的肝湿重显著高于N-CK组。用EE-MO干预2周后，D-LM和Z-LM组与M-CK组小鼠肝湿重无显著性差异，而G-LM组肝湿重显著低于M-CK组。

　　2.2 EE-MO处理对NAFLD小鼠模型肝TC、TG、HDL-C、LDL-C及FFA含量的影响

　　如图1：A所示，高脂饮食8周后，M-CK组小鼠血清的TC和TG含量均显著高于N-CK组。EE-MO能够剂量依赖性降低模型组小鼠血清TC和TG的含量。血清LDL-C和HDL-C含量的变化趋势与TC和TG含量变化趋势类似。M-CK组小鼠血清的LDL-C和HDL-C含量均显著高于N-CK组，用EE-MO处理后，NAFLD小鼠模型的LDL-C和HDL-C含量均显著降低 (图1：B)。高脂饮食后，M-CK组血清的FFA含量显著高于N-CK。用不同剂量提取物处理后，D-LM和Z-LM组的血清FFA含量与M-CK组无显著性差异，而G-LM组显著低于M-CK组 (图1：C)。

　　2.3 EE-MO处理对NAFLD小鼠模型血清ALT和AST活性的影响

　　如图2所示，NAFLD小鼠模型血清ALT和AST的变化趋势类似，高脂饮食诱导血清ALT和AST活性均显著增加。EE-MO处理后，NAFLD小鼠模型的ALT和AST活性显著下降，且具有剂量依赖性，即血清ALT和AST的活性大小顺序为D-LM>Z-LM>G-LM。

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文章名称： 辣木叶乙醇提取物对非酒精性脂肪肝小鼠模型血脂和氧化应激影响的研究

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