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作者：薛飞;唐洪辉;季峰;岳海涛;梁锦前;
单位：徐州医科大学淮安临床学院;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院骨科;
摘要：目的：探讨新型Nrf2激活剂CBR-470-1对DEX诱导的成骨细胞的作用机制。方法：体外培养小鼠MC3T3-E1成骨细胞，分为对照组、DEX组、CBR-470-1组和联合组，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Nrf2和Keap1基因表达、蛋白质免疫印迹实验（WB）检测NRF2和KEAP1蛋白水平、半胱天冬酶活性检测细胞凋亡、TUNEL法检测细胞凋亡、CCK-8法检测细胞活性、乳酸脱氢酶（LDH）检测细胞毒性。进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立Nrf2基因敲除小鼠MC3T3-E1成骨细胞系、通过慢病毒构建Nrf2/PGK1基因敲低小鼠MC3T3-E1成骨细胞，分为对照组、DEX组和联合组，检测Nrf2/ARE基因表达、细胞凋亡、细胞活性及细胞毒性。结果：CBR-470-1组的Keap1和Nrf2 mRNA表达与对照组比较，差异均无统计学意义（P均>0.05）。CBR-470-1组NRF2蛋白水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。对照组、CBR-470-1组和联合组Caspase-3/Caspase-9活性均显著低于DEX组；对照组、CBR-470-1组和联合组TUNEL阳性核细胞数均少于DEX组；对照组、CBR-470-1组和联合组的细胞相对活性均显著高于DEX组；对照组、CBR-470-1组和联合组的细胞存活率均显著低于DEX组，差异均有统计学意义（P均<0.05）。敲低/敲除Nrf2的小鼠MC3T3-E1成骨细胞中Nrf2/ARE mRNA表达缺失；敲低/敲除Nrf2的小鼠MC3T3-E1成骨细胞中ARE mRNA相对表达均低于正常细胞。正常细胞与敲低/敲除Nrf2的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的DEX组、联合组细胞相对活性均低于对照组；DEX组、联合组中，敲低/敲除Nrf2的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的细胞相对活性均低于正常细胞；正常细胞与敲低/敲除Nrf2的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的DEX组、联合组细胞存活率均高于对照组；敲低/敲除Nrf2的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的细胞存活率均低于正常细胞；正常细胞与敲低/敲除Nrf2的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的DEX组、联合组的TUNEL阳性核细胞数均高于对照组；敲低/敲除Nrf2的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的TUNEL阳性核细胞数均低于正常细胞，差异均有统计学意义（P均<0.05）。敲低PGK1的小鼠MC3T3-E1成骨细胞中Nrf2/ARE mRNA表达显著高于正常细胞；DEX组敲低PGK1的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的细胞相对活性高于正常细胞；联合组敲低PGK1的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的细胞相对活性低于正常细胞；DEX组敲低PGK1的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的TUNEL阳性核细胞数低于正常细胞；联合组敲低PGK1的小鼠MC3T3-E1成骨细胞的TUNEL阳性核细胞数高于正常细胞，差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论：新型Nrf2激活剂CBR-470-1通过激活Nrf2通路，显著抑制DEX诱导的成骨细胞凋亡，具有治疗骨质疏松的潜在应用前景。
关键词：地塞米松;;细胞凋亡;;Nrf2通路;;CBR-470-1
基金资助：国家自然科学基金委员会面上项目（82072477）
