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作者：陈文轩;索静霞;孔嘉华;葛晓敏;裘鑫珠;汤新明;余芳;索勋;刘贤勇;
单位：中国农业大学动物医学院;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所;
摘要：补体成分C5a作为免疫调节分子，近年已被证实可作为分子佐剂应用于新型疫苗开发。为了探索C5a作为球虫活载体疫苗分子佐剂的可行性，本试验通过同源序列比对和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增兔补体C5a基因，并通过生物信息学方法对兔C5a序列和C5a蛋白质二、三级结构进行预测和分析；构建包含兔出血症病毒1型（RHDV1）的VP60蛋白P2亚域基因和C5a基因的质粒，通过子孢子核转染和在家兔体内连续传代获得转基因早熟大型艾美耳球虫，采用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）和间接免疫荧光试验（IFA）对该转基因虫株进行鉴定。结果显示，兔C5a基因大小为222 bp，与人、猪和牛的C5a核苷酸序列同源性为71.2%～77.0%，与小鼠和大鼠的C5a核苷酸系列同源性为68.5%。预测结果显示，C5a是主要由4个α螺旋构成的单体蛋白，含有过敏毒素同源结构域。本试验获得了第1代发荧光的卵囊并连续传代至第15代，其中第9代转基因虫株的发光率最高（39.5%，满足鉴定阈值），对其鉴定结果显示，P2-C5a基因已成功插入并在虫株中表达，表达的P2-C5a融合蛋白主要定位于子孢子胞浆中。结果表明，转基因早熟大型艾美耳球虫初步构建成功，为后续进行C5a在转基因早熟大型艾美耳球虫中的佐剂效应研究提供了材料。
关键词：早熟大型艾美耳球虫;;兔出血症病毒1型(RHDV1);;P2亚域;;补体C5a
基金资助：国家兔产业体系-兔寄生虫病防控岗位科学家（CARS-43-3）
