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作者：栾晶;魏冬梅;黄高翔;郭夏宁;翟翠;郭娜;徐浩;贠丹丹;张臻昊;苟兴春;
单位：陈志南院士工作站,西安医学院基础与转化医学研究所;陕西科技大学化学与化工学院天然产物稳定同位素组学实验室;中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院病理科;西安医学院基础医学部;上海市浦东医院风湿免疫科;
摘要：目的 对比分析分步抗体孵育(A-P-A)法和一步抗体孵育(P-A)法两种胞内染色方法对流式细胞术检测抗体中位数荧光强度(MFI)、阳性细胞比例、组间差异性的影响。方法 取12周龄不同处理组的雄性昆明小鼠外周血及脾脏细胞，采用两种不同的胞内染色方案，检测并对比分析各组样本免疫细胞亚群比例、 MFI和不同处理组的组间差异性。结果 小鼠外周血细胞样本中，使用5种抗体以及PerCP-Cy5.5-7-AAD染料，在不同处理组中，两种方案MFI均值的组间变化趋势一致；有4种抗体在不同处理组中，两种方案的MFI均值的组间变化趋势不一致。两种孵育方案中，A-P-A法的MFI值更为敏感，在组内可重复性较差，误差值较大。两种抗体孵育方法中活细胞比例在组间差异不大，有3种免疫细胞的比例在两种不同孵育方法中获得的结果在不同组间的变化趋势相反，其余5种细胞亚群在两种不同孵育方法中，组间变化趋势一致。经统计，Ly-6c-high单核细胞的比例在A-P-A法的不同处理组之间比较有显著统计学差异，而P-A法中Ly-6c-high单核细胞的比例在不同处理组之间无统计学差异，两种孵育方法组间变化趋势一致。M1型巨噬细胞的比例在P-A法的不同处理组之间比较有显著统计学差异，而A-P-A法中M1型巨噬细胞的比例在不同处理组之间无统计学差异，两种孵育方法组间变化趋势一致；小鼠脾脏细胞样本中，方案中所使用的9种抗体的MFI值在两种方案的组间变化趋势均一致。整体上，A-P-A法中各抗体MFI值的组间差异性大于P-A法。同样，本方案中所检测的所有免疫细胞亚群比例以及活细胞比例在两种方案的组间变化趋势均一致。其中，活细胞比例和Ly-6c-low单核细胞的比例，在A-P-A法中的组间差异有显著性，在P-A法中的组间差异无显著性。M2巨噬细胞比例，在P-A法中的组间差异有显著性，在A-P-A法中的组间差异无显著性。结论 在小鼠外周血样本两种孵育方案中，A-P-A法的MFI值和淋巴细胞亚群比例变化更为敏感，在组内可重复性较差，误差值较大，但从统计结果上看两种方法不分伯仲，从实验方案的简便性上考虑，建议选择P-A法。小鼠脾脏细胞样本在两种抗体孵育方案下，所有抗体MFI值和免疫细胞亚群比例在组间变化趋势一致，A-P-A法中各抗体MFI值的组间差异性大于P-A法，检测各免疫细胞亚群比例的组间差异性，两种方法不分高下。
关键词：流式细胞术;;抗体孵育;;中位数荧光强度;;阳性细胞比例
基金资助：国家自然科学基金青年项目(82302032);; 陕西省科技厅创新能力支撑计划科技资源开放共享平台(2023-CX-PT-03);; 西安医学院科技创新团队项目(2021TD05);西安医学院博士启动项目(205012306);; 陕西省科学技术协会青年人才托举计划项目(20220610)
