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作者：李子镛;任金瑞;吴香菊;丛晓燕;李均同;齐静;王晓晔;胡悦;杜以军;
单位：广西大学动物科学技术学院/广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室/广西兽用生物制品工程研究中心/动物疾病预防与控制重点实验室;山东省农业科学院畜牧兽医研究所山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室;农业农村部畜禽生物组学重点实验室;
摘要：旨在构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP4蛋白及其3个主要结构域的过表达慢病毒载体，包装慢病毒并检测4种慢病毒在人单核细胞白血病细胞THP-1和猪肺泡巨噬细胞PAM中的表达。试验以质粒pXJ41-HA-NSP4为模板，分别扩增NSP4全长及其3个结构域NSP4-DⅠ、NSP4-DⅡ、NSP4-DⅢ片段，连接到pCD513B慢病毒表达载体中，构建重组质粒pCD513B-NSP4、pCD513B-NSP4-DⅠ、pCD513B-NSP4-DⅡ、pCD513B-NSP4-DⅢ;将慢病毒重组质粒与包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染HEK-293T细胞，包装获得4种重组慢病毒rLV-NSP4、rLV-NSP4-DⅠ、rLV-NSP4-DⅡ、rLV-NSP4-DⅢ,并感染HEK-293T细胞测定病毒滴度；分别将4种重组慢病毒感染THP-1细胞、PAM细胞，荧光显微镜观察目的蛋白表达，荧光定量PCR(qPCR)检测目的基因转录水平，Western blot检测不同感染时间目的蛋白表达水平。结果：4种慢病毒rLV-NSP4、rLV-NSP4-DⅠ、rLV-NSP4-DⅡ、rLV-NSP4-DⅢ感染HEK-293T细胞的病毒滴度分别为2.2×10~6、2.8×10~6、2.5×10~6和2.5×10~6 TU/mL;荧光显微镜观察显示4种慢病毒感染THP-1细胞和PAM细胞后阳性细胞数均随时间的增加而增多；qPCR结果表明目的基因转录水平在慢病毒感染后60 h内随着感染时间增加而升高；Western blot表明4种慢病毒能够成功感染THP-1细胞和PAM细胞并稳定表达相应的目的蛋白，且蛋白表达水平随着感染时间增加而升高。综上，本研究成功包装PRRSV NSP4及其3个主要结构域重组过表达慢病毒，为进一步研究PRRSV NSP4及其3个结构域的功能奠定了基础。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒;NSP4;慢病毒载体;鉴定
基金资助：山东省自然科学基金项目(ZR2023MC076,ZR2021ZD08,ZR2021MC139); 国家自然科学基金项目(32373094,32102710); 国家兽用生物制品工程技术研究中心开放课题[GTKF(23)009]
