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作者：任向阳;丁宁;苗子毅;黄献培;潘一峰;柏建山;黎浩权;袁建文;陈进会;张险朋;
单位：广东省口岸安全智能化检测重点实验室/黄埔海关;黄埔海关技术中心;广州海关技术中心;汕尾市海洋产业研究院;广州白云机场海关综合技术服务中心;东莞市人兽共患病重点实验室/东莞市动物疫病预防控制中心;
摘要：【目的】建立适合鲤春病毒血症病毒（SVCV）、锦鲤疱疹病毒（KHV）、神经坏死病毒（NNV）和病毒性出血性败血症病毒（VHSV）联合检测的环介导等温扩增（LAMP）微流控芯片检测体系，为4种鱼类病毒等温快速联检提供技术支撑。【方法】根据病毒SVCV、KHV、NNV和VHSV各自保守基因设计LAMP引物，预包埋LAMP引物至微流控芯片，注入等温扩增反应试剂，通过电浸润法将反应试剂驱动至各反应位点，复溶预包埋的LAMP引物，在各反应位点进行等温扩增反应。分析该检测体系的特异性、灵敏性和重复性验证，并应用于实际样品检测。【结果】本研究建立的LAMP微流控芯片检测体系对SVCV、KHV、NNV和VHSV阳性样品均出现特异性扩增反应，且不同病毒间未出现交叉反应；对鱼类易感的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、大口黑鲈虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、本尼登虫（Benedenia girellae）和刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）等8种常见病原体阳性样品均无特异性扩增反应。灵敏度实验结果表明，对SVCV、VHSV的检测限均为10 fg/μL，对KHV、NNV的检测限均为1 fg/μL。重复性实验结果表明，4种病毒的变异系数均<5%。该检测体系与实时荧光PCR方法相比，对20份实际样品的检测结果均保持一致。【结论】本研究建立的LAMP微流控芯片检测体系于63℃等温扩增30 min即可完成对SVCV、KHV、NNV和VHSV的同时检测，且特异性好、灵敏度高、重复性好，可为鱼类SVCV、KHV、NNV和VHSV等温快速联检提供技术支撑。
关键词：环介导等温扩增微流控芯片技术;;鲤春病毒血症病毒;;锦鲤疱疹病毒;;神经坏死病毒;;病毒性出血性败血症病毒
基金资助：广东省口岸安全智能化检测重点实验室资助项目（2023B1212010011）;; 汕尾市2023年度省级科技专项资金（“大专项+任务清单”）项目（2023A014）;; 东莞市社会发展科技项目（20231800939872）;; 东莞市2021年省乡村振兴战略专项资金（“大专项+任务清单”）项目（20211800400112）
