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作者：高青;孙河;王丽媛;庞庆宝;
单位：浙江中医药大学生命科学学院;黑龙江中医药大学;黑龙江中医药大学附属第一医院;
摘要：目的 探究通窍明目Ⅳ号方对青光眼视神经损伤的可能保护机制。方法 将通窍明目Ⅳ号方拆方为疏肝方、明目方。30只大鼠随机分为全方组、疏肝组、明目组、正常组、维生素B_(12)组，每组6只。全方组给予通窍明目Ⅳ号方94.5 g/（kg·d）灌胃，疏肝组给予疏肝方40.5 g/（kg·d）灌胃，明目组给予明目方54.0 g/（kg·d）灌胃，正常组给予蒸馏水18.9 ml/（kg·d）灌胃，维生素B_(12)组给予维生素B_(12) 50μg/（kg·d）灌胃。每日灌胃1次，连续7天后腹主动脉采血，分离血清。视网膜前体细胞系R28细胞分为空白组、模型组、正常血清组、全方血清组、疏肝血清组、明目血清组、维生素B_(12)血清组，每组3个复孔。除空白组外，其余各组使用L-谷氨酸诱导R28细胞损伤模型（采用筛选出的诱导浓度和时间）。造模后空白组和模型组不予血清干预；正常血清组去除培养基加入10%正常组血清；全方血清组、疏肝血清组、明目血清组去除培养基加入10%相应中药组血清；维生素B_(12)血清组去除培养基加入10%维生素B_(12)血清。各组细胞继续培养48 h后，采用CCK-8法检测细胞活力（包括细胞存活率、抑制率）；PI/Hoechst双染法检测细胞凋亡，比较染色荧光强度平均值；荧光探针法检测活性氧簇（ROS）含量；免疫荧光法、Western Blot法、qRT-PCR法分别检测NOD样受体热蛋白结构域蛋白3/含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶1/白细胞介素1β(NLRP3/Caspase-1/IL-1β)信号通路相关蛋白及mRNA表达。结果 筛选出浓度20 mmol/L的L-谷氨酸处理细胞48 h以诱导细胞损伤模型。与空白组比较，模型组R28细胞存活率降低、细胞抑制率升高，PI/Hoechst染色细胞荧光强度平均值升高，细胞中ROS含量、NLRP3/Caspase-1/IL-1β相关蛋白及其mRNA表达亦升高（P<0.05）。与模型组比较，各药物血清干预组上述各指标均不同程度改善（P<0.05）。且全方血清组在降低抑制率、PI/Hoechst染色荧光强度平均值、ROS含量、NLRP3/Caspase-1/IL-1β相关蛋白及其mRNA表达优于维生素B_(12)血清组（P<0.05）。全方血清组、疏肝血清组PI/Hoechst染色荧光强度平均值低于明目血清组（P<0.05）。全方血清组NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Caspase-1、IL-1β mRNA表达均低于疏肝血清组、明目血清组（P<0.05）。结论 通窍明目Ⅳ号方可能通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路，减轻程序性细胞坏死，从而有效缓解视网膜神经元凋亡，达到视神经保护的作用。
关键词：原发性青光眼;;视神经;;通窍明目Ⅳ号方;;细胞凋亡;;活性氧簇;;NOD样受体热蛋白结构域蛋白3;;含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶1;;白细胞介素1β
基金资助：国家自然科学基金(82074497)
