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作者：杜琳;李国贤;杜春晓;陈隽睿;李宇翔;王智鼎;李葛;韩根成;
单位：军事医学研究院,神经免疫与抗体工程实验室;河南大学,抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室;火箭军士官学校;
摘要：目的 T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)在天然免疫应答及适应性免疫应答调控中起关键作用，被视为新的免疫治疗靶点。本研究旨在实验室原有靶向人Tim-3的鼠源抗体基础上，借助计算机辅助分子设计，构建靶向人Tim-3的哺乳动物细胞抗体库，并筛选出功能改进的抗体。方法 整合计算机辅助分子模型构建平台与哺乳动物细胞抗体库技术，对Tim-3母本序列进行设计优化；通过Overlap PCR、载体的酶切、酶连与转化等分子生物学技术，得到靶向Tim-3哺乳动物抗体库的质粒库；通过测序比对获得全新序列抗体，利用ELISA技术进行筛选，获得表达量高、亲和力高的抗体；进一步通过体外功能实验(实时定量PCR、 CCK-8)验证优化抗体的功能。结果 以实验室前期制备的抗人Tim-3鼠源抗体为母本，利用计算机辅助设计平台，在Tim-3轻链与重链分别设计引入5个关键氨基酸替换；通过Overlap PCR分别获得3个含有突变碱基的轻链(L-1、 L-2、 L-3)和重链(H-1、 H-2、 H-3),连接载体后转化入TOP10电转感受态细胞，成功构建富含序列多样性的抗体分子质粒库。对新抗体进行序列的分析比对，筛选并纯化得到亲和力高于母本的抗体，命名为1号抗体。实时定量PCR检测表明，1号抗体阻断巨噬细胞系RAW264.7细胞和小胶质细胞系BV2细胞后，β干扰素(IFN-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、 IL-6的基因转录水平明显上调；阻断Jurkat~(Tim-3-high)细胞后，IL-2、 IFN-γ的基因转录水平明显上调，且1号抗体的阻断作用大于母本Tim-3抗体。CCK-8法检测证明了1号抗体促进Jurkat~(Tim-3-high)细胞的增殖，且1号抗体的促进作用大于母本Tim-3抗体。结论 通过计算机辅助分子设计平台和哺乳动物抗体库技术，得到亲和力高于母本抗体、且能够提高人和小鼠细胞系多种细胞因子表达的全新序列的Tim-3人源抗体。
关键词：T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3);;哺乳动物细胞抗体库;;计算机辅助分子设计
基金资助：国家自然科学基金(82171753)
