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作者：李威;吴辉亮;张澳晴;王英英;郑树城;李莹莹;莫绪兵;任燕;潘厚军;尹纪元;施雯;周文礼;王庆;
单位：天津农学院水产学院;中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室;东北农业大学动物科学技术学院;
摘要：为了给基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV-Ⅱ)诊断方法的建立和相关基因工程疫苗的研制提供材料，试验采用PCR方法扩增了GCRV-ⅡVP6 N端蛋白编码基因，将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中，构建重组表达质粒pET32a(+)-VP6-N,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，构建重组菌pET32a(+)-VP6-N/BL21,经IPTG诱导并优化诱导条件表达GCRV-ⅡVP6 N端蛋白，并对表达的重组蛋白进行可溶性分析，采用Western-blot分析重组蛋白的抗原性，以纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，采用间接ELISA法测定多克隆抗体效价，采用体外中和试验测定多克隆抗体的体外中和效价。结果表明：扩增出大小为684 bp的GCRV-ⅡVP6 N端蛋白编码基因，构建的重组表达质粒pET32a(+)-VP6-N的PCR鉴定、酶切鉴定结果均与预期大小一致且无碱基突变。重组菌pET32a(+)-VP6-N/BL21诱导后超声破碎沉淀在40 ku处出现特异性条带，与预期蛋白质分子质量大小一致；而上清液未出现明显特异性条带。重组蛋白表达的IPTG最佳诱导浓度为0.6 mmoL/L,最佳诱导时间为6 h。重组蛋白能够与GCRV-Ⅱ阳性草鱼血清发生特异性反应，但与健康草鱼血清不发生反应。所制备多克隆抗体效价为1∶1 000 000,体外中和效价为1∶40。说明试验成功表达了重组GCRV-ⅡVP6 N端蛋白并制备了多克隆抗体，重组蛋白以包涵体形式存在，具有良好抗原性和免疫原性，制备的多克隆抗体效价较高且具有中和活性。
关键词：草鱼呼肠孤病毒;;VP6 N端蛋白;;原核表达;;多克隆抗体;;抗原性;;中和活性
基金资助：国家重点研发计划项目(2023YFD2400704);; 国家大宗淡水鱼产业技术体系项目(CARS-45);; 中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(2024CG02;2024XT0603;2023TD49);; 2022年省级乡村振兴战略专项资金种业振兴项目(2022-SPY-00-018);; 中国水产科学研究院珠江水产研究所基本科研业务费项目(2023SJXT2);; 广东省农村科技特派员下乡服务专项(KTP20240575)
