来源：期刊VIP网 时间：
作者：杨成友;罗鸿;王涛;谢志鸿;梁亮;李凡超;吴建华;张飞;彭吾训;
单位：贵州医科大学临床医学院;贵州医科大学附属乌当医院骨科;贵州医科大学附属医院急诊骨科;贵州省人民医院;
摘要：目的：探讨膜相关酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(PKMYT1)在糖皮质激素（GC）诱导的成骨细胞（OB）凋亡中的作用，为早期激素性股骨头坏死（SANFH）提供理论基础和治疗靶点。方法：（1）选取小鼠颅盖骨成骨样细胞（MC3T3-E1）进行研究，control组使用普通培养基培养，实验组进行成骨诱导培养，通过碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色（ARS）验证成骨能力。使用不同浓度的GC处理小鼠成骨细胞（mOB），通过膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（AnnexinⅤ-FITC/PI）双染色法检测细胞凋亡，细胞计数试剂盒-8(CCK8)检测细胞增殖，蛋白质免疫印迹（WB）检测抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL-2)和促凋亡蛋白切割的半胱天冬酶-3和切割的半胱天冬酶-9(cleaved caspase 3/9)的表达。通过蛋白组学测序找出可能调控GC诱导mOB凋亡的分子。进一步通过实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）及WB分析PKMYT1表达。（2）选择不同浓度PKMYT1抑制剂GSK-1520489A处理mOB，以筛选合适抑制剂浓度，进一步分组为control组、GC组、GSK-1520489A组和GC+GSK-1520489A组，通过WB检测各组细胞PKMYT1和凋亡相关蛋白BCL-2、cleaved caspase 3/9的表达，CCK8实验检测细胞活性及细胞毒性，5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EDU）检测细胞增殖，细胞活死染色和AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测凋亡。（3）使用PKMYT1过表达慢病毒感染mOB，通过免疫荧光、q PCR和WB验证过表达效率。过表达PKMYT1成功后，将细胞分为control组、GC组、PKMYT1过表达（OE）组和OE+GC组，通过EDU检测细胞增殖，AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法和细胞活死染色检测凋亡。（4）为了验证人成骨细胞（hOB）中PKMYT1变化，选取健康人股骨头提取的hOB为control组，激素性股骨头缺血性坏死（hSANFH）患者股骨头提取的hOB为hSANFH组，通过qPCR和WB检测两组细胞中PKMYT1表达。结果：（1）小鼠颅盖骨成骨样细胞（MC3T3-E1）诱导分化成熟后，在GC作用下，相较于control组，实验组中随着GC浓度增加，AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测显示mOB凋亡细胞比例增多（P<0.01）;CCK8实验显示细胞活性降低（P<0.01）;WB检测显示BCL-2表达降低（P<0.01）、cleaved caspase 3/9表达均升高（P<0.01）。蛋白组学测序显示GC处理成熟的mOB后PKMYT1表达降低。（2）不同浓度PKMYT1抑制剂GSK-1520489A处理m OB，随着浓度增加，细胞活性降低，细胞毒性增加（P<0.001）。相对于control组，GSK-1520489A组中m OB增殖减少（P<0.001）,mOB凋亡增多（P<0.001）；相较于单独使用GC组，使用GC+GSK-1520489A组中m OB增殖减少（P<0.05）,mOB凋亡增多（P<0.01）。（3）过表达PKMYT1后，相对于control组，OE组中mOB增殖增加（P<0.001）,m OB凋亡未见明显增多（P>0.05）。相对于GC组，OE+GC组中m OB增殖增加（P<0.001）,m OB凋亡减少（P<0.001）。（4）在人股骨头组织中提取hOB,q PCR和WB结果表明hSANFH组中PKMYT1表达低于control组（P<0.001）。结论：PKMYT1表达下调促进GC诱导的m OB凋亡；相反，过表达PKMYT1抑制GC诱导的mOB凋亡。PKMYT1可能成为SANFH早期治疗的潜在靶点。
关键词：激素性股骨头坏死;;PKMYT1;;成骨细胞;;凋亡;;增殖
基金资助：国家自然科学基金(82260429、82260434、82460426);; 贵州省科技计划项目(黔科合基础-ZK[2022]一般399);; 贵州医科大学国家自然科学基金培育项目(21NSFCP08);; 贵州省卫生健康委员会科学技术基金(gzwjkj2020-1-128)
