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作者：马祎芳;赵佳慧;马清龙;高鹏程;曾巧英;李学瑞;储岳峰;
单位：甘肃农业大学动物医学院;中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学院与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室;
摘要：为方便临床上检测腐败梭菌血清样本，以及评价腐败梭菌疫苗对动物的免疫效果，本试验利用大肠杆菌表达系统诱导α毒素重组蛋白的表达，经纯化后免疫BALB/c小鼠，制备α毒素单克隆抗体。以筛选的单抗为捕获抗体，通过棋盘滴定法优化反应条件，建立腐败梭菌α毒素抗体的竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法，利用该方法检测绵羊血清样本的阴阳性临界值，并评估其重复性、灵敏度、特异性和符合率，同时检测牛血清样本的阴阳性临界值。结果显示，成功诱导表达和纯化出约65 kDa的目的蛋白；通过杂交瘤技术筛选获得1株稳定分泌特异性抗体的单抗8H2；竞争ELISA最佳抗原包被条件为300 ng/孔、16 h，血清稀释度为1∶1，单抗稀释度为1∶2 000，封闭条件为1%牛血清白蛋白（BSA）、90 min，血清和单抗竞争时间为90 min，二抗稀释度为1∶15 000、孵育30 min，显色时间为15 min；该方法检测绵羊血清样本的阳性临界值为27.19%，阴性临界值为22.59%；批间和批内变异系数均低于10%，重复性良好；标准阳性血清稀释度为1∶16时仍为阳性；与产气荚膜梭菌、布鲁氏菌和鼠伤寒沙门菌均无交叉反应，特异性良好；利用该方法检测100份绵羊血清样本，与间接ELISA的检测总符合率为89.00%(89/100)；检测牛血清样本的阳性临界值为20.00%，阴性临界值为16.30%。本试验成功制备了1株腐败梭菌α毒素特异性单抗，并构建了抗体竞争ELISA检测方法，为腐败梭菌病的早期诊断和疫苗免疫效果评价提供了技术支撑。
关键词：腐败梭菌;;α毒素;;单克隆抗体;;竞争ELISA
基金资助：兰州市科技计划项目（2023-1-14）;; 国家重点研发子课题：羊梭菌三联四防基因工程亚单位疫苗研发（2023YFD1802504-04）;; 中国农业科学院创新工程项目（CAAS-ASTIP-2021-LVRI）
