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作者：姜小寒;王海伟;李鑫;
单位：中国农业大学动物医学院兽医公共卫生安全全国重点实验室;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室;
摘要：为了利用反向遗传技术构建表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组脑心肌炎病毒（rEMCV-EGFP），并探究其生物学特性，本试验通过融合聚合酶链式反应（PCR）构建表达EGFP的重组质粒pCI-EMCV-EGFP，将该重组质粒转染幼年叙利亚仓鼠肾细胞-21(BHK-21)细胞，获得重组荧光病毒rEMCV-EGFP。利用EMCV 2C蛋白多抗，通过间接免疫荧光（IFA）和蛋白免疫印迹（WB）对rEMCV-EGFP进行鉴定，并通过生长曲线测定、蚀斑试验和遗传稳定性试验进一步分析其生物学特性。经测序验证，成功构建重组质粒pCI-EMCV-EGFP;rEMCV-EGFP成功表达EGFP;rEMCV-EGFP感染后36 h才出现典型细胞病变，与EMCV野生毒株和rEMCV相比延迟约6 h。IFA和WB鉴定结果显示，rEMCV-EGFP能够在表达EGFP的同时正常表达EMCV 2C蛋白。生长曲线测定和蚀斑试验结果显示，与EMCV野生毒株和rEMCV相比，rEMCV-EGFP感染后各时间点病毒滴度均显著降低（P<0.000 1或P<0.001或P<0.01或P<0.05）；蚀斑直径和数量均极其显著减少（P<0.000 1）。遗传稳定性试验结果显示，rEMCV-EGFP连续传代6次均能成功表达EGFP，且通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术可稳定检测到EGFP基因。结果表明，本试验利用反向遗传技术成功构建重组荧光病毒rEMCV-EGFP，为EMCV致病机制的研究、组织嗜性分析、抗病毒药物筛选和新型疫苗开发提供了关键平台。
关键词：脑心肌炎病毒(EMCV);;反向遗传技术;;增强型绿色荧光蛋白(EGFP);;重组病毒
基金资助：国家自然科学基金面上项目（32373020）
