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作者：陈晓洁;王钢;耿尚景超;黎明;郑侃;杨延丽;肖燕;贺笋;
单位：天康制药股份有限公司;天康生物制药有限公司;
摘要：为了建立产气荚膜梭菌重组α毒素（rCPA）蛋白的高效液相尺寸排阻色谱（HPSEC）定量方法，并评价其在疫苗工艺开发中的应用范围，本试验通过HPSEC、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blot）鉴定rCPA蛋白标准品及其色谱峰；筛选HPSEC色谱柱型号，优化流动相pH、盐浓度和检测流速；建立HPSEC检测rCPA蛋白的标准曲线，系统验证该方法的专属性、检测限、准确度、日内精密度和日间精密度，并评估该方法在rCPA蛋白细菌培养上清样品、浓缩样品和灭活样品中检测rCPA蛋白的适用性。结果显示，SDS-PAGE检测rCPA蛋白标准品纯度> 90%,HPSEC纯度> 95%;Zenix SEC-150色谱柱具有最优分离度、对称性和色谱峰面积；最优流动相为p H 6.8含有100 mmol/L NaCl的125 mmol/L磷酸盐缓冲液；最优流速为0.6 mL/min。HPSEC具有专属性和良好的线性（R~2=0.999 98）；检测限在4.9μg/mL以下；HPSEC检测高、中、低3个浓度的r CPA蛋白标准品准确度介于96.2%～99.5%，准确度较高；日内和日间精密度良好，相对标准偏差均<5%；该方法适用于细菌培养上清中r CPA蛋白浓度的实时监测，以及浓缩样品和灭活样品中r CPA蛋白浓度的测定。结果表明，本试验所建立HPSEC定量方法适用性好、重复性好、准确度高，能应用于r CPA蛋白生产不同阶段样品的质量控制，指导疫苗工艺开发。
关键词：高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC);;产气荚膜梭菌重组α毒素(rCPA);;定量;;质量控制
基金资助：新疆维吾尔自治区“天池英才”领军人才项目（ZH04）
