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作者：马文阁;戴海越;吴浩;刘宇昕;于越洋;王爽;孙玮玮;吴文学;
单位：中国农业大学动物医学院兽医公共卫生安全全国重点实验室农业农村部动物流行病学重点实验室;
摘要：为快速、高效地检测重组杆状病毒（rBV）的滴度，以缩短rBV的研发周期，精准把控其生产工艺和支撑其临床前安全评价，本试验利用杆状病毒表达系统中的pFastBac Dual质粒作为实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测的标准模板，以rBV基因组DNA作为检测模板，针对质粒和rBV共有的转座子序列设计引物，通过条件优化建立rBV的qPCR检测方法，并验证其特异性、重复性、准确度和精密度；以免疫染色法为对照，结合病毒生长动力学，评价2种方法在实际应用中的相关性、一致性和等效性。结果显示，qPCR法的最适退火温度为60℃，最优上游和下游引物浓度分别为4和2μmol/L；可特异性识别rBV；批间和批内变异系数均小于10%，重复性良好；理论检测值和实际检测值的相对误差和相对标准偏差均小于10%，准确度和精密度良好。在3.324×10~3～3.324×10~8 copies/μL范围内标准曲线呈现线性关系，最低检测限是33.24 copies/μL。对本实验室制备的34株rBV的检测结果显示，qPCR法检测值高于免疫染色法，但2种方法检测结果经Pearson相关性分析证实呈显著正相关（r=0.891 9,P<0.000 1），且经Bland-Altman一致性分析显示具有较好的一致性。rBV生长动力学比对显示，2种方法检测结果无显著差异（P > 0.05），具有等效性。结果表明，本试验成功建立了一种快速、有效的qPCR法，可在2 h左右准确测定rBV滴度，普遍适用于检测由细菌-杆状病毒穿梭表达系统构建的rBV，为其定量分析、工艺优化和质量控制提供了基础。
关键词：重组杆状病毒;;细菌-杆状病毒穿梭表达系统(Bac-to-Bac);;实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR);;滴度
基金资助：国家重点研发计划(2022YFD1800700);; 国家现代农业产业技术体系项目(CARS36);; 中国博士后科学基金面上资助(2024M753562)
