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作者：董钰蓓;郭承意;吴雨晴;马梓承;蒋珽;高雁怩;姜平;白娟;
单位：南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室;
摘要：基于CRISPR/Cas9基因编辑平台，对仓鼠肾细胞(BHK-21)及猪睾丸细胞(ST)这2种细胞系实施Bcl2l1基因定向敲除，为探究B细胞淋巴瘤2类似蛋白1(Bcl2l1)基因编码的Bcl-xL蛋白在塞内卡病毒A(SVA)感染鼠源和猪源细胞中的作用及分子机制提供试验材料。首先设计并合成5条靶向Bcl2l1基因的sgRNA,分别连接到慢病毒载体Lenti CRISPR v2上；将构建好的慢病毒质粒转染至人胚胎肾细胞(HEK293T),获得重组慢病毒并感染BHK-21和ST细胞；再经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得Bcl2l1基因敲除的细胞株；通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)和Western blot验证Bcl2l1基因的敲除情况；通过CCK8法分别检测Bcl2l1基因敲除对BHK-21和ST细胞活性的影响。结果：筛选得到5株Bcl2l1基因缺失的细胞系，即3株Bcl2l1基因敲除鼠源细胞系(Bcl2l1~(-/-)BHK-21)和2株Bcl2l1基因敲除猪源细胞系(Bcl2l1~(-/-)ST);RT-qPCR及Western blot结果显示，与野生型细胞系相比，Bcl2l1基因敲除细胞系的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.001);CCK8试验结果显示，Bcl2l1基因敲除的BHK-21细胞系在增殖能力方面与野生型相比未出现明显变化。在ST细胞系中，Bcl2l1基因的缺失导致了显著的增殖能力下降，与野生型ST细胞形成鲜明对比；Western blot和RT-qPCR试验均显示，Bcl2l1基因敲除后显著抑制了SVA的增殖(P<0.000 1)。综上，本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了敲除Bcl2l1基因的BHK-21细胞系和ST细胞系，并证实Bcl2l1基因在SVA复制中发挥着重要作用，为深入研究Bcl2l1基因的功能提供了理想的细胞模型。
关键词：Bcl2l1基因;;基因敲除;;BHK-21细胞;;ST细胞;;塞内卡病毒A
基金资助：国家重点研发计划项目(2022YFD1800800);; 现代农业产业技术体系专项(CARS-35)
