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作者：郑好;陈志;杨霞;张素;赵一萌;汤君宇;曹静怡;李瑾瑜;赖沁妍;高丽;曹红;郑世军;王永强;
单位：中国农业大学动物医学院兽医公共卫生安全全国重点实验室农业农村部动物流行病学重点实验室;
摘要：为明确鸡胚成纤维细胞（DF-1）禽膜穿孔蛋白E(chGSDME)基因与病毒诱导的禽源细胞焦亡的相关性，本试验根据成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白（CRISPR/Cas9）基因编辑系统原理，设计靶向chGSDME基因的向导RNA(sgRNA)，构建敲除质粒并转染至DF-1细胞，对转染成功的细胞进行单克隆培养，随后通过蛋白免疫印迹（WB）和基因测序筛选出成功敲除chGSDME基因的细胞（命名为DF-1-ΔchGSDME），检测其活性并进行细胞功能验证。结果显示，本试验成功构建敲除质粒和chGSDME基因敲除细胞，即DF-1-ΔchGSDME细胞；与野生型DF-1(WT)细胞相比，DF-1-ΔchGSDME细胞活性无显著差异（P > 0.05）,chGSDME基因敲除不影响细胞正常生长；禽呼肠孤病毒（ARV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）和水疱性口炎病毒（VSV）感染WT细胞后，均可诱导细胞焦亡；与WT细胞相比，感染ARV、IBDV和VSV后，DF-1-ΔchGSDME细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）含量显著减少（P<0.01或P<0.05），可以抑制病毒引起的细胞焦亡。结果表明，本试验成功构建了1株chGSDME基因敲除DF-1细胞，chGSDME基因与病毒诱导的禽源细胞焦亡具有明显相关性，为后续chGSDME基因的深入研究提供了参考。
关键词：CRISPR/Cas9;;基因敲除;;禽膜穿孔蛋白E(chGSDME);;鸡胚成纤维细胞(DF-1)
基金资助：国家自然科学基金(32072850);; 国家现代农业产业技术体系-蛋鸡(CARS-40)
