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作者：张蓝月;王颖超;刘唯夷;尚雪恬;贾红彦;朱传智;张宗德;潘丽萍;
单位：首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所/耐药结核病研究北京市重点实验室;
摘要：目的:探索硫醇乙酰基转移酶MshD对结核分枝杆菌在体外生长、应对压力刺激和活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平的影响。方法:利用CRISPR-NHEJ基因编辑技术，构建结核分枝杆菌mshD基因敲除株(ΔmshD株)和回补株(ΔmshD::mshD株)。分别检测H37Rv野生株(WT)、ΔmshD株和ΔmshD::mshD株在液体培养基和固体培养基中的生长情况，以及外源添加L-半胱氨酸和过氧化氢酶对菌株生长的影响；检测3种菌株对不同刺激剂如H_2O_2、二硫苏糖醇(DTT)、十二烷基硫酸钠(SDS)的敏感性，以及外源添加过氧化氢酶对压力条件处理后菌株的恢复情况；采用流式细胞术检测SDS处理3种菌株前后菌株的ROS水平。结果:与WT和ΔmshD::mshD株相比，ΔmshD株在固体平板上的生长较为缓慢，外源添加过氧化氢酶可以恢复其生长趋势；ΔmshD株应对DTT [WT(6.96±2.02)%,ΔmshD(0.02±0.00)%,ΔmshD::mshD(6.64±0.77)%;F=29.700,P<0.001],H_2O_2[WT(0.23±0.06)%,ΔmshD(0.01±0.00)%,ΔmshD::mshD(0.26±0.06)%;F=25.520,P=0.001]和SDS[WT(0.12±0.03)%,ΔmshD(0.01±0.00)%,ΔmshD::mshD(0.18±0.04)%;F=19.540,P=0.002]刺激的存活率更低，差异均有统计学意义；外源添加过氧化氢酶可以恢复其存活率。ΔmshD株自身ROS水平高于WT(WT:95.100±2.553,ΔmshD:106.000±4.000,ΔmshD::mshD:94.667±3.055;F=11.650,P=0.009),SDS处理ΔmshD株的自身ROS水平进一步升高(WT:436.000±8.000,ΔmshD:533.667±4.726,ΔmshD::mshD:441.333±2.517;F=292.900,P<0.001),差异均有统计学意义。结论:mshD基因缺失在固体培养基中生长减慢，mshD基因协助结核分枝杆菌抵抗各种应激压力，ΔmshD菌株内源性ROS水平增加。外源添加过氧化氢酶可一定程度恢复mshD基因敲除株生长和存活缺陷。
关键词：分枝杆菌,结核;;乙酰基转移酶类;;过氧化氢酶;;活性氧
基金资助：通州区卫生发展科研储备项目(KJ2024CX064);; 北京市自然科学基金(7242025);; 北京市医院管理中心青年职工创新工作室(202136)~~
