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作者：黄宇杰;傅昕;张何;马文杰;豆玉豪;陈勇;罗家美;
单位：湖南工程学院材料与化工学院,湖南省环境催化与废弃物再生化重点实验室;
摘要：牛结核分枝杆菌是一类可影响畜群健康并构成公共卫生风险的革兰氏阳性细菌，快速、准确检测牛血液中低丰度的牛结核分枝杆菌DNA对于牛结核病的早期诊断、疾病防控及养殖管理具有重要意义。本研究建立了一种基于双功能杂交链式反应（HCR）与规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a系统（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-CRISPR associated proteins 12a, CRISPR/Cas 12a）串联式启动酶促信号放大的高灵敏“Turn-off”型牛结核分枝杆菌比色传感技术。靶标牛结核分枝杆菌DNA存在时，触发DNA发夹H1与H2之间的杂交链式反应，形成具有多个原间隔区相邻基序（PAM）位点的DNA纳米线形重复序列结构，在DNA纳米线形结构上完成与Cas12a/gRNA二元复合物的识别与结合，串联式激活CRISPR/Cas12a顺式切割和反式切割活性。在scgRNA中，采用设计有不匹配的碱基序列iDNA-F和iDNA-B探针构建scgRNA的凸起结构，此结构可充当激活Cas12a蛋白的反式切割底物。切割后由于双链熔点（T_m）值降低，导致链解旋，释放出scgRNA中的抑制探针（Inhibitor）。抑制探针可与下游的HP1探针结合，有效抑制HP1和HP2探针自发组装形成G-四链体结构，进而阻止G-四链体-血红素DNA酶的形成，体系在420 nm处的吸光度显著降低。在最优实验条件下，对牛结核分枝杆菌特异性核酸序列的线性检测范围为1～100 nmol/L，检出限（LOD=3σ/S）为76 pmol/L，回归方程为ΔA_(420 nm)=0.09956 lg C+0.0555(R~2=0.9845)。将本方法用于牛血液中牛结核分枝杆菌的检测，加标回收率为98.3%～108.0%。本方法操作简单、选择性好、灵敏度高，可用于牛血中牛结核分枝杆菌的高灵敏、快速检测。
关键词：规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a系统;;杂交链式反应;;牛结核分枝杆菌;;核酸检测;;酶促信号放大
基金资助：湖南省重点研发计划项目(No.2020SK3019);; 湖南省教育厅资助科研项目(Nos.25A0529,23A0529);; 化学生物传感全国重点实验室开放课题(湖南大学);; 区域遗传性出生缺陷防控研究湖南省重点实验室开放课题项目(No.HPKL2023021)资助~~
