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作者：张一帆;陈胜利;金祥瑞;金珊宇;梁晋嘉;兰仕梅;李章程;储岳峰;史耀旭;郝华芳;
单位：中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室;甘肃省病原生物学基础学科研究中心;中农威特生物科技股份有限公司;
摘要：为建立山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）的抗体检测方法，筛选Mccp潜在诊断靶标——假定膜蛋白HP65，以纯化的rHP65蛋白为包被抗原，通过优化条件，建立间接ELISA抗体检测方法，并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估和临床应用。结果显示，rHP65蛋白大小约72 k Da;Western-blot证实该蛋白与Mccp阳性血清具有良好的反应性。建立的ELISA方法的最佳条件为：抗原包被量为180ng/孔，37℃孵育2h后4℃过夜包被，10 g/LBSA37℃封闭90 min，血清1∶200稀释后37℃孵育1 h，酶标二抗1∶10 000稀释后37℃孵育1h；底物在37℃显色10 min。与绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种、小反刍兽疫病毒和衣原体的阳性血清均无交叉反应，具有良好的特异性，敏感性达1∶10 240。批内和批间重复性变异系数均低于10%。应用该方法对Mccp免疫、感染血清和临床血清进行检测，疫苗免疫7d可检测到血清抗体转阳、人工感染血清7～14d可检测到血清阳性，187份临床血清中有102份阳性、85份阴性。以上结果表明，基于HP65蛋白建立的ELISA方法可用于山羊传染性胸膜肺炎疫苗免疫抗体检测，为该病临床诊断试剂盒开发奠定了基础。
关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种;;山羊传染性胸膜肺炎;;HP65蛋白;;原核表达;;间接ELISA
基金资助：甘肃省科技重大专项（23ZDNA007）;; 甘肃省2024年度重点人才项目（2024RCXM36）;; 中国农业科学院创新工程项目（CAAS-ASTIP-2021-LVRI）
