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篇(1)
摘要：【目的】明確中同水仙植株根际土壤微生物群落的组成特征。【方法】采用Illumina Miseq高通量测序技术对水仙根际土壤微生物样品的保守基因区进行测序及生物信息学分析，阐明中同水仙根际土壤的细菌、真菌和^菌群落结构组成，并对水仙根际土壤微生物的优势菌属进行深入分析。【结果】共获得优化序列175840条，基于97%序列相似度，聚类为2 680个OTUs。优势细菌类群是绿弯菌门Chloroflexi( 30.86%)和变形菌门Proteobacteria(20.67%)，真菌以子囊菌门Ascomycota(84.94%)为主，属水平上球毛壳菌Chaetomium globosum( 28.15%)和散子囊菌Eurotiales( 25.01%)占较高比例。占菌类群主要为奇^菌门Thaumarchaeota( 51.40%)、深^菌门Bathyarchaeota(25.98%)和广古菌门Euryarchaeota( 20.65%)。其中，来自奇古菌门的SCG类群(25.67%)和嗜酸性氨氧化古菌Candidatus Nitrosotalea( 12.93%)占较高比例。【结论】中国水仙根际土壤微域具有丰富多样的微生物类群，这对于开发和利用水仙根际土壤微生物资源具有重要意义。
关键词：中国水仙;根际土壤微生物;高通量测序;细菌;真菌;^菌
引言
【研究意义】中国水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem.)是石蒜科多年生草本植物，原产我国，已有一千多年栽培历史，独具天然丽质，芬芳清新，素洁幽雅，是我国十大观赏名花之一，观赏价值极高，在园林造景中也有广泛应用。近年来，很多研究揭示了植物根际一土壤一微生物之间的相互作用机制，探明中国水仙根际土壤微生物群落分布特征对于解析中国水仙的生态生存机制具有重要意义[1-3]。但目前对中国水仙根际土壤微生物群落组成的认知仍然有限，尤其对水仙根际土壤真菌和古菌的群落水平鲜有报道，从而不能深入解析水仙根际土壤微生物與水仙生长发育的关系。【前人研究进展】水仙根际土壤微生物组成与栽培方式、地理位置及水仙的生长习性等密切相关[4]。体外喷施有效微生物群制剂，可显著促进水仙花的生长发育[5]。已有研究证实，大量微生物类群具有促进植物生长的机制。Ryu等[6]从拟南芥根际土壤鉴定出2种菌株，它们释放出的一些挥发性物质极大促进了拟南芥的生长。此外，从芽孢杆菌属、假单胞菌属和黄杆菌属中，分离到多种可增强植物抗病性的促生菌菌株[7-9]。根际土壤微生物也包括可以抑制植物生长甚至导致植株死亡的根际“有害菌，”如根腐病病原菌[1O]、青枯病病原菌[11]等，它们普遍分布在根际土壤环境中，略微积累，就有可能影响根际土壤微生物群落的稳定，产生有害物质，抑制植物根系对土壤养分的吸收，严重可导致植物死亡。根际环境成为土壤一根系一微生物互作的关键区域，被称作植物的第二基因组[12]，根际土壤微生物影响着植物的生长发育，近年来一直是科学家们研究的热点。【本研究切入点】福建省漳州市具有栽培水仙花的得天独厚的地理环境，可提供研究水仙根际土壤微生物群落结构、功能及其与植物互作的理想土壤材料。然而水仙根际土壤菌群结构的组成特征及根际细菌、真菌和古菌的关键微生物类群组成亟待深入探讨。【拟解决的关键问题】采集在漳州培育的漳州水仙根际土壤，利用高通量测序技术，对根际土壤中细菌、真菌和古菌群落的组成进行系统鉴定，分析水仙根际土壤环境中优势的微生物类群，并对其生物功能进行探讨，以期揭示中国水仙根际土壤微生物的群落分布特征，为解析水仙花的环境适应性机制以及建立科学合理的水仙花种植制度提供理论依据。
1材料与方法
1.1根际土壤微生物样品采集
土壤样品于2020年4月25日在福建省漳州市“水仙花海”园区进行漳州水仙金盏银台根际土壤的采集。用5点取样法采集水仙根际土壤，去除土壤表层杂草和凋落物，在水仙植株的根部一侧小心挖掘，待改侧植株根系露出后，用毛刷刷取黏附在根表面的土壤。共采集5处样地的水仙根际土壤，每处样地选择3株植株，每处土样总采样量约为50 g，各样点土壤混匀后，封入灭菌的50 mL离心管，置于冰盒带回实验室。约20 g新鲜土样用于根际土壤核酸样品提取，剩余部分置于通风橱中，静置24h，磨细后过0.25 mm筛，用铝箔纸收集，用于土壤理化性质测定。
1.2土壤理化性质测定
用梅特勒一托利多pH计测定土壤pH;土壤有机质含量采用重铬酸钾( K2Cr207)法测定[13];土壤的全氮含量采用凯氏定氮法测定[14];采用碱解扩散法[15]、NaHCO，浸提法[16]和醋酸铵浸提一火焰光度法[17]测定土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量。采用乙酸铵离心法测定土壤阳离子交换量( Cation ExchangeCapacity，CEC)[18];用梅特勒一托利多电导率仪测定土壤电导率;采用石墨炉原子吸收光谱法测定土壤中铅( Pb)含量[19]。
1.3 DNA抽提和PCR扩增
根际土壤微生物DNA样品依据PowerSoil?DNAIsolation kit( MoBio.U.S.)说明书的操作进行，DNA的质量、浓度和纯度通过1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000鉴定;使用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')[20]对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增;使用524FlOextF(5'-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3')和Arch958RmodR(5'-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3，)[21]对古菌16S rRNA基因的特异区间进行PCR扩增;使用SSU0817F(5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ')和1196R(5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3，)[22]对真菌18S rRNA基因的特异区间进行PCR扩增。扩增程序如下：95℃3 nun，35个循环(95℃30 s，58℃30 s，72℃30s)，72℃15 min，最后4℃保存(PCR仪：ABI Verity? 96型)。PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu 4 uL，2.5 mmol·L-l dNTPs 2 uL，上游引物(5umol·L-l) 0.8uL，下游引物(5 umol·L-I) 0.8 uL，TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 uL，模板DNA 10 ng，使用灭菌双蒸水将体系补足至20 uL。每个样本设置3个重复。
1.4 Illumina Miseq测序
使用2%琼脂糖凝胶分离PCR产物，然后对相应胶条进行切割回收，利用MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit( TaKaRa，Japan)进行回收产物纯化，并用QuantusrM Fluorometer( Promega，USA)对回收产物进行检测定量。建库依据NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit进行，具体步骤如下：①在DNA片段两端连上特定序列的接头;②利用样品本纯化磁珠进行片段筛选;③通过PCR扩增实现原始模板的富集;④将PCR扩增后的文库进行分选回收。采用Illumina Miseq测序技术(上海美吉生物医药科技有限公司)对文库进行高通量测序分析。原始数据上传至NCBI SRA数据库(序列号：SAMA16825444，Genbank登录号：PRJNA679159)。
篇(2)
摘要：为制定酒庄生产废水灌溉的可行性、安全性标准提供理论依据，以宁夏回族志辉源石(ZHYS)、银色高地(YSGD)、沃尔丰(WEF)、米擒(MQ)4个酒庄生产废水灌溉区绿化带土壤为研究对象，以清水灌溉区为对照，分析酒庄生产废水灌溉对绿化带土壤微生物群落与土壤理化性质的影响，以及废水灌溉区土壤理化性质和微生物群落之间的关系。废水灌溉后，4个酒庄土壤的pH值均升高，部分酒庄绿化带土壤全盐、有机质含量较对照组升高，而全磷、速效钾、速效磷含量降低。对土壤微生物群落结构的分析表明：废水灌溉使米擒和志辉源石酒庄土壤的香农(Shannon)和Chao1指数降低。2种水质灌溉下，优势种群均为变形菌门(Proteobacteria)，其次是酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，其含量分别为26.34%～39.77%、18.77%～31.24%、4.45%～13.13%;废水灌溉抑制了土壤中变形菌门、酸杆菌门、放线菌门微生物的生长，促进了土壤中拟杆菌门(Bacteroidetes)微生物的生长。从属水平变化来看，废水灌溉降低了Gp4、Gp6在米擒和志辉源石酒庄的相对丰度，分别降低14.65%、19.69%和17.54%、10.99%。废水灌溉降低了芽单胞菌属(Gemmatimonas)在沃尔丰、银色高地、志辉源石酒庄绿化带土壤的相对丰度，分别降低23.95%、7.63%、29.67%;提高了Aridibacter的相对丰度，分别提高30.33%、13.44%、6.58%和24.24%。废水灌溉提高了米擒、沃尔丰、银色高地酒庄绿化带土壤中Gp7的相对丰度，分别提高5.56%、24.32%、61.54%。碱解氮含量、电导率、速效钾含量、全磷含量、pH值是影響绿化带土壤微生物群落的主要环境因子。在严格把控废水水质指标的情况下，用酒庄生产废水灌溉绿化带土壤是可行的。
关键词：土壤微生物;生产废水;酒庄;绿化带;群落;理化性质
我国2018年年用水总量为6 015.5亿m3，其中农业用水量占61.4%[1]，淡水资源短缺，环境问题日益严重，减少农业用水量势在必行。工农业生产用水紧张，我国北方地区分布较多干旱区域，水资源短缺成为限制农业发展的主要因素，通常采用污水灌溉、节水措施来补充农田灌溉用水不足的问题[2]。废水灌溉是目前的研究热点和难点，污水处理技术日益成熟，处理后的污水达到国家灌溉水质要求后可用于灌溉农田、草地园林等。污水灌溉既是污水的资源化利用，也是缓解水资源匮乏的有效措施[3]。化学需氧量(COD)在10 000 mg/L以上的葡萄酒废水，属于高浓度有机废水，采用单一的工艺无法使出水达标，国内外一般采用组合工艺处理葡萄酒废水[4]。
目前，相关研究多集中在城市生活污水、农产品加工废水、农村生活用水、养殖废水、农业生产废水对土壤养分、微生物群落的影响等方面，这类污水的氨氮和COD含量较高，多环芳烃、重金属等有毒有害物质在水中含量较少，适用于农业灌溉[4-8]。但是，关于酒庄废水灌溉后对土壤各项指标的影响，尤其是对土壤微生物群落影响的相关研究较少。土壤微生物被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[9]。土壤综合肥力指数随着微生物多样性指数的升高呈上升趋势。因此，研究酒庄生产废水灌溉对绿化带土壤微生物群落结构与土壤理化性质的影响具有重要意义。污水灌溉不仅会造成土壤污染，且污水中含有的N、P等营养元素，回灌后也会影响土壤养分含量，对土壤微生物及土壤酶活性产生一定的刺激作用。焦志华等研究发现，再生水灌溉会使大豆根际土壤中有机质、有效磷含量增加，使土壤酶活性发生改变，同时再生水也会对大豆根际土壤中细菌及真菌数量造成一定的影响[4]。
宁夏回族自治区作为我国葡萄酒生产核心地区之一，优质水资源稀缺，而每年灌溉葡萄以及葡萄酒生产榨季的需水量很大。酒庄生产废水的大量排放不仅造成区域环境污染，而且造成大量水资源的浪费。酒庄生产废水对环境有2个方面的效应：一方面，废水中含有大量的营养元素，这些元素是植物生长所必需的，如果根据相关水质要求对酒庄生产废水进行处理，合理灌溉不仅能够改善土壤环境、提高土壤肥力，而且还可以通过促进土壤微生物的繁殖来影响植物的生长;另一方面，由于葡萄酒生产废水含有高浓度的有机污染物，未经处理而直接排放会对环境造成严重的污染，废水散发臭味且高色度，须经过一定处理达到国家排放的标准后方才可以排放。本研究采用经过处理后的废水灌溉绿化带土壤，测定并分析土壤的细菌群落和土壤理化性质的变化规律，从而探究酒庄废水处理后灌溉绿化带对土壤质量的影响，以期为酒庄生产废水再利用安全风险评估指标提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 研究区域概况
研究区域属于温带大陆性气候，处于银川平原西部边缘。土壤以砾石土为主，还有风沙土、灌淤土以及未被开垦的戈壁荒滩，土壤贫瘠，有机质含量低，透水性较强，土壤持水量低，降水量为150～240 mm。本研究以宁夏贺兰山东麓米擒(MQ)、沃尔丰(WEF)、银色高地(YSGD)、志辉源石(ZHYS)4个酒庄绿化带土壤为研究对象，同时以酒庄生产废水灌溉区和清水灌溉绿化带土壤为对照，分析生产废水灌溉对绿化带土壤各项指标的影响。绿化带灌溉为滴灌，酒庄生产废水经一定措施处理后进行灌溉，对照灌溉区则一直采用清水进行灌溉。酒庄基本信息及其生产废水水质指标如表1、表2所示。宁夏米擒、沃尔丰、银色高地、志辉源石4个酒庄总排口废水监测到的各项指标均符合GB 5084—2021《农田灌溉水质标准》的要求。因此，酒庄总排口废水水质适于灌溉。
1.2 土壤样品采集及预处理
2019年9月分别采集4个酒庄的生产废水灌溉区和正常灌溉区的土壤，采样之前铲除土壤表面的杂草和草根，每块采样地选取有代表性的样点采集10～30 cm深度的土壤。在同一酒庄进行多点采样后充分混合，分成2个部分装入无菌密封袋中，一部分土样保存于4 ℃冰箱中用于测定土壤微生物多样性，另一部分在室内进行风干处理，拣去土样中的杂物，用0.25 mm和1 mm的筛网分离土壤，装入密封袋用于土壤理化性质的测定。
1.3 土壤理化性质测定
土壤pH值采用pH计测定(土水比为 1 g ∶2.5 mL)，全盐含量采用电导率测定，碱解氮含量采用碱解扩散法测定，重铬酸钾容量法(外加热法)测定有机质含量，凯氏定氮法测定全氮含量，用HClO4-H2SO4钼锑抗比色法测定全磷含量，NaHCO3浸提法测定速效磷含量，乙酸铵浸提法测定速效钾含量[10-11]。
1.4 土壤DNA提取
采用的是DNA试剂盒(MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit)提取土壤样品总DNA。DNA片段大小用浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测[11-13]。
1.5 Illumina HiSeq测序及数据分析
本研究选取细菌的16S rRNA V4区基因片段进行检测，引物为515F/806R(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。聚合酶链式反应(PCR)体系如下：15 μL 高保真聚合酶(New England Biolabs生产)、0.2 μmol/L正反引物、10 ng DNA模板[11，13]。PCR产物检测回收后进行后续分析。
高通量测序由上海生工Illumina HiSeq 2500平台运行，所测目标片段长度为250～300 bp[11-13]。原始数据(Tags数据)经所测得原始序列截去条形码序列和引物序列后，经FLASH(V1.2.7)拼接获得。通过软件QIIME处理过滤原始数据获得高质量Tags数据，并与数据库进行比对检测嵌合体序列，获得有效数据。对有效序列进行聚类分析，利用RDP classifier(v2.2)软件[12-16]与Greengenes数据库进行物种注释，以获得土壤样品中细菌群落的多样性信息。
土壤微生物主要进行的是定性分析，即土壤微生物多样性指数分析、微生物群落在门水平的变化分析、微生物群落在属水平的变化分析、聚类分析、微生物群落在门水平相对丰度与土壤环境因子的冗余度排序分析(RDA)。微生物多样性指数分析用来反映微生物群落的多样性，指数越大表明群落的复杂程度也越高;可从门、属水平来分析微生物群落构成差异。经过RDA可以检测土壤环境、样品、群落结构之间的关系。
1.6 数据处理
采用SPSS 25.0软件进行差异显著性分析;微生物群落在门、属水平用物种丰度柱形堆积图来表示，用R的gplots package软件进行分析;微生物群落在门水平相对丰度与环境因子相关性分析，采用RDA法，所用软件同上。
2 结果与分析
2.1 土壤理化性质
如表3所示，4个酒庄的土壤pH值为9.30～9.58，属于典型的碱性土壤。各酒庄生产废水灌溉土壤的pH值均略高于清水灌溉。除了银色高地酒庄(YSGD)之外，其他3个酒庄废水灌溉土壤与清水灌溉土壤pH值差异显著(P<0.05)。除志辉源石酒庄(ZHYS)和沃尔丰(WEF)之外，其他2个采样地废水灌溉土壤电导率高于清水灌溉;其中，米擒(MQ)、银色高地(YSGD)废水灌溉区土壤电导率分别比清水灌溉高38.78%和7.87%。速效钾含量在废水灌溉土壤中均明显低于清水灌溉区;其中，沃尔丰(WEF)、志辉源石(ZHYS)废水灌溉土壤速效钾含量分别显著低于清水灌溉区23.53%和30.81%(P<0.05)。廢水灌溉区土壤速效磷含量均低于清水灌溉区;其中，沃尔丰(WEF)与志辉源石(ZHYS)废水灌溉区速效磷含量分别低于对照组19.0%和5.8%。废水灌溉的大部分土壤中全磷含量均低于清水灌溉区，其中志辉源石酒庄(ZHYS)废水处理土壤全磷含量高于清水灌溉55.32%。米擒酒庄(MQ)与沃尔丰(WEF)酒庄废水灌溉土壤有机质含量高于清水灌溉土壤31.29%和3.45%(P<0.05);在银色高地(YSGD)和志辉源石(ZHYS)废水灌溉土壤有机质含低于清水灌溉区，其中志辉源石酒庄(ZHYS)与CK土壤有机质含量差异显著。米擒酒庄(MQ)废水灌溉土壤碱解氮含量最高，为17.03 mg/kg，高于对照组73.78%，其他3个酒庄土壤碱解氮含量差异不显著。
2.2 土壤细菌多样本聚类分析
在聚类分析中，样本之间的距离以树枝长度表示，当样本聚集到一起时其相似度越高。如图1所示，将相似性标准值定位0.8，样本可分成2类：一类是米擒酒庄(MQ、MQ_CK)，另一类是志辉源石、沃尔丰、银色高地酒庄(ZHYS_CK、ZHYS、WEF_CK、WEF、YSGD_CK、YSGD)。废水灌溉与清水灌溉使得银色高地酒庄(YSGD、YSGD_CK)土壤细菌群落结构的差异较大，其他酒庄的2种水灌溉对土壤细菌群落影响较小。
2.3 土壤微生物多样性指数
微生物群落多样性指标包括香农指数(Shannon)、Chaol、辛普森指数(Simpson)及分类操作单元(OTU)，常被用于评价土壤微生物功能多样性，它们的指数越高，表明样品中的物种多样性程度越高。如表4所示，OTU数目在米擒酒庄(MQ)废水灌溉处理中最低;在志辉源石酒庄(ZHYS)废水灌溉的土壤中OTU数目显著少于清水灌溉处理。在米擒(MQ)和志辉源石酒庄(ZHYS)土壤废水灌溉处理中Shannon指数低于清水灌溉，且在米擒酒庄(MQ)废水灌溉的土壤细菌群落多样性最低。在米擒(MQ)和志辉源石(ZHYS)酒庄土壤废水灌溉处理中Chao1指数低于清水灌溉，且在米擒酒庄(MQ)用废水灌溉的土壤细菌群落多样性最低;Simpson指数在米擒酒庄(MQ)废水灌溉土壤中达到最大值，在WEF、YSGT采样地Simpson指数与CK没有显著差异。
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