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作者：李建铭;侯晋辉;徐广鑫;高俊龙;史郑婷;赵睿;袁晋;
单位：河南农业大学动物医学院;河南农业大学动物病原与生物安全教育部重点实验室;河南农业大学河南省动物性食品病原监测实验室;
摘要：【目的】构建一种能够高效区分胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）自然感染和疫苗免疫猪的检测方法，以便准确评估APP自然感染流行情况。【方法】将以低温诱导表达的可溶性蛋白APP ApxⅣ作为包被抗原，采用方阵滴定法优化各反应条件，初步建立针对APP ApxⅣ的间接ELISA抗体检测方法，并对该方法的特异性、敏感性、重复性及与商品化试剂盒的符合率进行评估。【结果】抗原最适包被质量浓度为0.75 mg·L~(-1)，包被条件为37℃1 h+4℃14 h；最适封闭液为质量分数2%的海藻糖，封闭条件为37℃1.5 h；血清最适稀释倍数为50倍，孵育条件为37℃1 h；酶标二抗最适稀释倍数为10 000倍，孵育条件为37℃30 min；最适显色条件为25℃10 min。该方法与猪链球菌、大肠杆菌和副猪嗜血杆菌等细菌的阳性血清无交叉反应，与猪圆环2型、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬等病毒的阳性血清无交叉反应，与APP灭活疫苗免疫猪的阳性血清无交叉反应。APP阳性血清稀释200倍后检测结果仍为阳性，批内及批间重复性试验的变异系数分别为1.31%～6.27%和0.73%～4.05%。随机选择200份临床血清进行检测，与商品化试剂盒的整体符合率达86.50%。【结论】基于APP ApxⅣ蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法特异灵敏，重复性好，符合率高，可以有效区分APP自然感染和疫苗免疫猪。
关键词：胸膜肺炎放线杆菌;;ApxⅣ蛋白;;间接ELISA;;抗体检测;;自然感染;;疫苗免疫
基金资助：国家自然科学基金青年基金项目（32402924）;; 国家重点研发计划青年科学家项目（2023YFD1801800）;; 河南省重点研发专项（231111113100）
