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作者：胡一凡;杜博平;吴亚东;朱传智;张蓝月;贾红彦;孙琦;潘丽萍;张宗德;李自慧;
单位：北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院/耐药结核病研究北京市重点实验室;
摘要：目的:探讨Mce4C蛋白是否参与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)摄取利用胆固醇。方法:利用定量PCR技术分析不同浓度胆固醇(无胆固醇组、0.01%胆固醇组和0.1%胆固醇组)对MTB mce4C基因表达的影响。通过紫外-可见分光光度计测定培养菌液A_(600)值绘制生长曲线和扫描电镜分析，了解MTB H37Rv野生株(WT)、mce4C基因敲除株(Δmce4C)和敲除回补株(Δmce4C+mce4C)的生长速率和形态差异。通过试剂盒定量测定或NBD-胆固醇荧光值测定菌体本身、培养基及感染细胞裂解液中胆固醇含量变化，明确Mce4C蛋白是否参与MTB摄取利用胆固醇。通过MTB不同组分分离结合免疫印迹实验明确Mce4C蛋白亚细胞定位。结果:mce4C基因表达量随苏通培养基中胆固醇浓度的升高(无胆固醇组、0.01%胆固醇组和0.1%胆固醇组)而升高，培养1周时mce4C相对表达量分别为1.000±0.588、1.390±0.162和3.622±1.031,差异有统计学意义(F=28.200,P=0.001)。随着胆固醇苏通培养基培养时间(20、40、60、70、80 d)的延长，Δmce4CA_(600)值相比WT和Δmce4C+mce4C降低逐渐明显，至第80天时，Δmce4C的A_(600)值(0.913±0.017)明显低于WT(1.245±0.011)和Δmce4C+mce4C(1.246±0.029),差异均有统计学意义(t=28.182,P<0.001;t=17.140,P<0.001)。用胆固醇苏通培养基培养3种菌株时，Δmce4C菌体胆固醇含量相比WT和Δmce4C+mce4C降低，而其培养上清中胆固醇含量升高，至21 d时，Δmce4C菌体总胆固醇含量[(1.058±0.012)μg/ml]明显低于WT [(1.347±0.087)μg/ml]和Δmce4C+mce4C[(1.505±0.021)μg/ml],而培养上清中Δmce4C胆固醇含量[(16.371±0.753)μg/ml]明显高于WT [(7.740±0.422)μg/ml]和Δmce4C+mce4C[(7.274±0.131)μg/ml],差异均有统计学意义(t=4.621,P=0.044;t=25.679,P=0.002;t=-14.135,P=0.005;t=-16.827,P=0.004)。在感染THP-1细胞不同时间点(4、24、48、72 h),Δmce4C感染细胞裂解液中胆固醇含量均明显高于WT和Δmce4C+mce4C,即使在感染4 h最低点时，Δmce4C感染细胞裂解液中胆固醇含量[(7.749±0.017)μg/ml]也高于WT [(7.180±0.173)μg/ml]和Δmce4C+mce4C[(6.725±0.288)μg/ml],差异均有统计学意义(t=-6.556,P=0.001;t=-7.106,P<0.001)。结论:mce4C基因的表达随培养基胆固醇浓度的升高而升高，mce4C基因敲除降低了MTB在含胆固醇苏通培养基中的生长速率及MTB菌体胆固醇含量，增加了培养基中及感染细胞裂解液中的胆固醇含量，表明Mce4C蛋白参与了MTB从外环境中摄取利用胆固醇，其编码基因缺失可使MTB在以胆固醇作为唯一碳源时的生长存在明显缺陷，这可能是MTB在人体内长期存活并可能致病的重要因素。
关键词：分枝杆菌,结核;;胆固醇;;营养需要;;能量摄取;;免疫蛋白质类
基金资助：国家自然科学基金(82070012,81702097);; 北京市自然科学基金(7212012);; 通州区两高人才工程运河计划项目(YH201908);; 北京市优秀人才培养资助项目(20081D0301300095)~~
