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作者：冯佳宁;邹森;赵泽林;李肖肖;张志斐;杨兆勇;
单位：华北理工大学药学院;中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所;
摘要：目的 瞬时转染重组人凝血因子X(rhFX)到HEK293细胞，优化转染条件，体外构建高效表达rhFX的方法，检测rhFX活性。方法 pc DNA3.1-EGFP与F10基因构建真核表达载体pc DNA3.1-EGFP-FX并转染HEK293细胞，验证转染系统的有效性。pc DNA3.1与F10基因片段构建重组表达载体pc DNA3.1-FX，脂质体方法转染HEK293细胞，Western blot和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测细胞上清液中rhFX的表达。优化转染条件，ELISA测定rhFX的浓度;凝血酶原时间(PT)和发色底物法测定rhFX凝血生物活性。结果 在HEK293细胞上清液中成功表达rhFX。在细胞密度80%，质粒DNA与聚乙烯亚胺(PEI)的比例为1∶2，转染后第3天，rhFX表达量最高。ELISA检测3次上清液表达量最高为5.20 ng/mL。与对照组pc DNA3.1空载体转染收集的上清液相比，实验组rhFX的PT时间更短(P<0.000 1)，基于rhFX的发色底物法测得依度沙班的半数抑制浓度(IC_(50))为1.449 nmol/L，与文献报导的0.78 nmol/L处于同一数量级。结论 使用HEK293细胞成功表达出具有生物活性的rhFX蛋白，为进一步推动rhFX药物的研发奠定基础。
关键词：重组人凝血因子X;;瞬时表达;;表达优化;;HEK293细胞;;凝血因子X缺乏症;;凝血酶原时间
基金资助：国家自然科学基金项目(编号:82373767、82301185)~~
