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作者：郭宏伟;刘妍;赵绪永;龚婷;马辉;刘薇;郑鸣;
单位：河南牧业经济学院食品与生物工程学院;河南农业大学生命科学学院;
摘要：为了探究猪氨基肽酶N(pAPN)病毒结合受体功能区域与传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的结合活性，本试验采用重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）技术将pAPN胞外区分为5段并与Fc片段融合，构建酵母分泌表达载体pPICZαA-pAPN-Fc进行融合表达，在分子和细胞水平对比分析5个Fc融合蛋白与PEDV和TGEV结合能力及对病毒核衣壳蛋白（N）基因mRNA转录和复制的影响，筛选潜在病毒结合受体功能关键区。结果显示，pAPN_1-Fc、pAPN_2-Fc、pAPN_3-Fc、pAPN_4-Fc和pAPN_5-Fc共5个融合片段均可在毕赤酵母X33中高效分泌表达，并可与pAPN兔多克隆抗体特异性结合。PEDV和TGEV结合活性酶联免疫吸附试验（ELISA）分析结果显示，pAPN_2-Fc、pAPN_3-Fc、pAPN_4-Fc、pAPN_5-Fc融合蛋白具有不同程度的PEDV和TGEV结合活性，且同种融合蛋白与TGEV的结合能力高于PEDV，其中pAPN_2(574～678aa)和pAPN_3(669～773aa)区域与病毒的结合能力较强。实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫荧光共聚焦试验结果显示，融合蛋白pAPN_2和pAPN_3-Fc抑制PEDV和TGEV N基因mRNA转录和复制的能力较强。结果表明，pAPN胞外区域574～773aa可同时结合PEDV和TGEV，并能抑制病毒N基因mRNA转录和复制能力，pAPN 574～773aa可能是PEDV和TGEV结合受体的共同关键区域。本试验结果可为PEDV和TGEV的感染机制研究及抗病毒药物设计提供理论依据。
关键词：猪氨基肽酶N;;肠道冠状病毒;;Fc融合表达;;病毒结合活性
基金资助：河南省科技攻关项目(222102110158);; 河南省自然科学基金面上科学基金项目(252300420187);; 河南省重点研发专项项目(251111110700)
