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作者：郝良玉;郭衍冰;王楠;孙兴忠;项钰;王改丽;崔鹤馨;姜乐凡;张天宇;宋建臣;曹利利;
单位：吉林省畜牧兽医科学研究院;延边大学动物医学系;
摘要：为更好利用昆虫杆状病毒表达系统对牛冠状病毒（BcoV）的主要结构蛋白N蛋白进行表达，本研究采用BCoV-N基因为目标设计特异性引物进行PCR扩增，通过无缝克隆技术将其插入昆虫杆状病毒系统转移载体pFastBacHT B，并构建pFastBacHT B-BCoV-N重组质粒。随即转化至DH10Bac大肠杆菌，经过蓝白斑筛选后提取阳性重组杆粒Bacmid-BCoV-N，转染至Sf9昆虫细胞产生杆状病毒并进行传代。结果表明，经双酶切、PCR验证，重组质粒与重组杆粒均构建成功，重组杆粒Bacmid-BCoV-N转染Sf9昆虫细胞并连续盲传5代后获得重组杆状病毒Bacmid-BCoV-N，成功表达纯化出BCoV-N蛋白，经SDS-PAGE及Western blot鉴定，其分子量大小约为55 kDa，具有良好的特异性。将50μg重组蛋白与弗氏完全佐剂充分混匀乳化后免疫小鼠，间接ELISA试验结果显示免疫小鼠产生了特异性抗体。综上所述，本研究构建的昆虫杆状病毒表达系统能够高水平地表达外源基因，可以满足后续建立免疫学抗体诊断检测技术的需要。
关键词：牛冠状病毒(BCoV);;核衣壳蛋白(N蛋白);;昆虫杆状病毒表达系统
基金资助：吉林省预算内基本建设资金(创新能力建设)计划(2024C015-2);; 吉林省科技创新平台和人才专项(20220505009ZP)
