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作者：邱梅玉;张雪梅;张宁;徐鑫;刘明军;
单位：新疆畜牧科学院生物技术研究所,农业农村部草食家畜遗传育种与繁殖重点实验室,新疆动物生物技术重点实验室;
摘要：为了构建增强型eGFP(Enhanced GFP)基因CRISPR/Cas9和引导编辑(Prime Editing,PE)相关载体，确定CRISPR/Cas9和PE对eGFP基因的编辑效率，本研究通过生物信息学对eGFP基因进行靶位点分析，人工合成eGFP sgRNA/15 bp缺失的pegRNA及niRNA，构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒；培养293T细胞，利用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和HiTOM深度测序，检测eGFP基因的FITC-A-Mean和细胞发生的编辑类型，同时预测不同编辑类型蛋白结构变化。结果发现，eGFP-sgRNA组的FITC-A-Mean显著低于阴性对照组；eGFP-PE2组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组；eGFP-PE3b组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组；Hi-TOM测序表明eGFP-sgRNA、eGFP-PE2和PE3b的编辑效率分别为20.420%、36.735%和40.180%;PE3b较PE2编辑效率提升3.445%;eGFP野生型蛋白二级结构中延伸链最多达到83个(34.73%),eGFP-CRISPR/Cas9-1bp插入蛋白二级结构中无规则卷曲达到144个(56.69%);eGFP-PE-15 bp缺失蛋白中延伸链最多达到85个(36.32%)。本试验成功构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒，转染后绿色荧光强度均极显著降低，CRISPR/Cas9编辑存在多种编辑形式，而PE编辑除15 bp缺失的精准编辑外存在比例较少的碱基替换，表明利用PE编辑系统可以实现精准编辑，为研究动物功能基因和精准分子育种领域奠定基础。
关键词：CRISPR-cas9;引导编辑(PE);eGFP基因;FITC-A-Mean;Hi-TOM深度测序
基金资助：新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题（2021D04001）; 新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（2022D01B176）; 第二批天山英才培养计划青年托举人才项目（2023TSYC QNTJ0021）
