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作者：张诚;郭闯豪;刘汝银;岳宗进;杨佳欣;
单位：河南中医药大学骨伤学院;河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)脊柱科;
摘要：目的 探究补肾壮骨汤含药血清外泌体对过氧化氢（hydrogen peroxide, H_2O_2）处理成骨细胞增殖分化的影响及作用机制。方法 提取与鉴定补肾壮骨汤含药血清外泌体。体外培养MC3T3-E1细胞，将细胞分为对照组、 H_2O_2组、补肾壮骨汤含药血清外泌体组（50和100μg/mL）、 LY294002+补肾壮骨汤含药血清外泌体（100μg/mL）组。细胞计数试剂盒8 (cell counting kit-8, CCK-8)法检测细胞存活率。5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2′-deoxyuridine, EDU）染色检测细胞增殖情况。免疫印迹检测磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）与蛋白激酶B (protein kinase B, Akt)的磷酸化水平和谷胱甘肽过氧化物酶4 (glutathione peroxidase 4, GPX4)蛋白表达。比色法检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性。二氢乙锭（dihydroethidium, DHE）染色检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。FerroOrange探针检测二价铁离子（ferrousion, Fe2+）水平。茜素红染色观察成骨细胞矿化。荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测破骨细胞抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory factor, OCIF）、Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ，COL1）和骨形态发生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2, BMP2) mRNA表达。结果 与对照组比较，H_2O_2组细胞存活率、增殖率、 GSH水平、 ALP活性、矿化结节形成及OCIF、 COL1和BMP2mRNA水平和磷酸化（phosphorylated, p） PI3K (p-PI3K)、 p-Akt、 GPX4蛋白表达显著降低（P<0.01）,ROS、 Fe2+和MDA水平则显著升高（P<0.01）。与H_2O_2组比较，补肾壮骨汤含药血清外泌体组细胞存活率、增殖率、 GSH水平、 ALP活性、矿化结节形成及OCIF、 COL1和BMP2 mRNA水平和p-PI3K、 p-Akt、 GPX4蛋白表达显著升高（P<0.01）, ROS、 Fe2+和MDA水平显著降低（P<0.01）。Akt信号抑制剂LY294002减弱了补肾壮骨汤含药血清外泌体对H_2O_2处理MC3T3-E1细胞的保护作用。结论 补肾壮骨汤含药血清外泌体通过激活PI3K/Akt/GPX4信号通路，减弱H_2O_2对细胞增殖和成骨分化的抑制作用。
关键词：补肾壮骨汤;;外泌体;;成骨细胞;;铁死亡;;细胞增殖;;成骨分化
基金资助：河南省中医药科学研究专项课题（2022ZY1092）
