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作者：朱文青;徐丽华;刘佳畦;邬雨倩;金子安;吴旭琪;袁秀芳;周继勇;郑肖娟;
单位：浙江大学动物医学中心农业农村部动物病毒学重点实验室;浙江省农业科学院畜牧兽医研究所;
摘要：D250R是非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染早期表达的具有脱帽酶活性的非结构蛋白。本研究构建了重组原核表达质粒pET-32a-D250R，经IPTG诱导和镍亲和纯化成功获得原核细胞表达的重组蛋白His-D250R，该蛋白和真核细胞表达的重组蛋白Flag-D250R均能被ASFV标准阳性血清识别，证明D250R蛋白是ELISA抗体检测方法的潜在靶标。在此基础上，以纯化的重组蛋白为免疫原制备小鼠源多克隆抗体，该抗体ELISA效价大于1∶409 600。Western-blot试验表明该抗体与Flag-D250R和His-D250R均具有良好的反应性，证明His-D250R蛋白具有良好的抗原性。进一步以His-D250R蛋白为包被抗原，通过对抗原包被、封闭、抗体孵育、底物反应等条件的优化，建立间接ELISA抗体检测方法。其阴阳性临界值为0.359，检测PRV、PRRSV、PCV2、CSFV等阳性血清结果均呈阴性，灵敏度达1∶3 200，批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%，与商品化试剂盒符合率达98.8%。上述结果表明，基于His-D250R蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性、重复性良好，具备一定临床应用价值，可以为非洲猪瘟诊断方法开发提供重要支持。
关键词：非洲猪瘟病毒;;D250R蛋白;;原核表达;;多克隆抗体;;间接ELISA
基金资助：浙江省基础公益计划项目（LGN22C180006）;; 国家重点研发计划项目（2021YFD1801301）
