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作者：李鹏亮;冷文静;刘佩仪;郑迎旭;崔小蝶;胡功政;
单位：河南农业大学动物医学院;
摘要：为了研究羟氯柳胺(oxyclozanide, OXY)和黏菌素(colistin, COL)联用对肺炎克雷伯菌生物被膜(biofilm, BF)形成的抑制和清除作用及其机制，试验采用微量肉汤稀释法测定OXY、COL单用及联用后对10株COL耐药肺炎克雷伯菌临床菌株(编号为KP01～KP10)的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC),采用96孔棋盘法测定两药联用对10株菌的部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index, FICI),随机选择1株菌采用激光共聚焦显微镜观察OXY、COL单用及联用对其的杀灭作用，采用结晶紫染色法测定10株菌的BF形成能力；选择BF形成能力较强的菌株采用BF抑制试验和清除试验分别探究两药联用对COL耐药肺炎克雷伯菌BF形成的抑制和清除作用；随机选择1株强BF形成能力菌株采用实时荧光定量PCR方法检测OXY、COL单用及联用后BF形成相关基因的mRNA转录水平变化。结果表明：10株肺炎克雷伯菌对COL和OXY均耐药，MIC分别为4～32μg/mL、64～128μg/mL;两药联用后，COL对10株肺炎克雷伯菌的MIC降低至原来的1/256～1/16,均由耐药变为敏感。两药联用对10株肺炎克雷伯菌的FICI在0.031 3～0.187 5之间(均小于0.500 0)。激光共聚焦观察可见，未用药处理的细菌未见死亡，OXY、COL单用处理的细菌极少量死亡且死亡细菌数量远少于存活细菌数量，两药联用处理的死亡细菌数量明显高于OXY、COL单用处理且存活细菌数量极少。10株COL耐药肺炎克雷伯菌中，2株BF形成能力强(KP07和KP09),8株BF形成能力中等。两药联用处理对细菌的抑制率和清除率均极显著高于OXY、COL单用处理(P<0.01)。两药联用处理细菌luxS、pgaA、mrkA、wbbM、fimA基因的mRNA相对表达量较未用药、COL和OXY单用处理均有降低趋势。其中，两药联用处理细菌luxS基因的mRNA相对表达量均极显著低于其他3个处理(P<0.01);pgaA基因显著低于未用药处理(P<0.05),极显著低于COL单用处理(P<0.01);mrkA基因极显著低于OXY和COL单用处理(P<0.01);wbbM基因极显著低于未用药和COL单用处理(P<0.01);fimA基因极显著低于OXY和COL单用处理(P<0.01),显著低于未用药处理(P<0.05)。说明OXY和COL联用可以有效抑制肺炎克雷伯菌BF的形成，并且能清除已形成的BF,这可能与联合用药可下调肺炎克雷伯菌BF形成相关基因mRNA的转录水平有关。
关键词：肺炎克雷伯菌;;生物被膜;;黏菌素;;羟氯柳胺;;联合用药
基金资助：国家自然科学基金项目(32373069)
