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作者：黄蓉;赵鑫鑫;薛慧;朱梦娟;涂佳杰;王鑫铭;
单位：安徽医科大学药学院;安徽医科大学第一附属医院药剂科;安徽医科大学临床药理研究所;
摘要：目的 采用CRISPR/Cas9技术构建髓细胞触发受体2(TREM2)基因敲除(TREM2~(-/-))小鼠，繁育TREM2~(-/-)小鼠并分析其基因型。方法 采用CRISPR/Cas9技术选择性敲除TREM2基因的外显子2～3区域，构建TREM2~(-/-)小鼠模型，所有小鼠的遗传背景均为C57BL/6J。采用聚合酶链式反应(PCR)法鉴定小鼠的基因型。实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测小鼠主要组织中TREM2的表达水平，从mRNA水平和蛋白水平上验证PCR鉴定结果的真实性以及科学性。根据sgRNA序列在CCTop网站预测出可能存在的脱靶位点，提取小鼠尾部DNA经PCR扩增后进行Sanger测序，检测TREM2~(-/-)小鼠有无产生脱靶效应。结果 通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TREM2~(-/-)小鼠，并对小鼠进行了基因型鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，仅扩增出415 bp条带的小鼠基因型为野生型(WT);仅扩增出449 bp条带的小鼠基因型为TREM2~(-/-);扩增出415 bp和449 bp双条带的小鼠基因型为杂合型。qPCR结果显示，与WT小鼠相比，TREM2~(-/-)小鼠的心脏、脑组织中TREM2的mRNA表达水平均下调(P<0.01),胸腺、肺组织中TREM2的mRNA表达也呈现下降趋势(P<0.05)。Western blot结果显示，与WT小鼠相比，TREM2~(-/-)小鼠的心脏、脑、胸腺、肺组织以及外周血单个核细胞(PBMC)中TREM2的蛋白表达水平均降低(P<0.01)。Sanger测序结果表明TREM2~(-/-)小鼠没有产生脱靶效应。结论 成功构建并繁育了TREM2~(-/-)小鼠，建立了一种可靠的基因型鉴定方法，并采用qPCR、Western blot以及Sanger测序分析，验证了小鼠模型遗传的稳定性，将为TREM2基因功能的研究提供重要的基因动物模型。
关键词：髓细胞触发受体2;;CRISPR/Cas9;;基因敲除;;聚合酶链式反应;;琼脂糖凝胶电泳;;基因型鉴定
基金资助：国家自然科学基金(编号：82104185);; 安徽省高校科研项目(编号：2022AH051153);; 安徽省自然科学基金(编号：2008085QH400);; 抗炎免疫药物教育部重点实验室(安徽医科大学)开放课题(编号：KFJJ-2020-03);; 安徽医科大学校科研基金(编号：2021xkj148)~~
