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作者：余荷仙;宋利华;何毓敏;张舒苒;石孟琼;杨振清;张继红;周刚;
单位：三峡大学基础医学院&肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室;三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室&药食同源大健康产品开发利用宜昌市重点实验室;国家中医药管理局中药药理科研三级实验室&三峡大学健康医学院;湖北民康制药有限公司;三峡大学中医医院&湖北省功能性消化系统疾病中医临床医学研究中心;
摘要：目的:建立淡附片HPLC指纹图谱及苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、大豆苷、黄豆黄苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、甘草酸、甘草苷10种成分含量测定方法，预测其质量标志物(Q-Marker);基于网络药理学及实验研究，探讨淡附片治疗心肾阳虚型慢性心力衰竭(Chronic heart failure, CHF)的分子作用机制。方法:采用HPLC法综合评价药材质量，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)建立淡附片HPLC指纹图谱，对共有特征峰进行指认及归属、评价不同批次样品之间的差异性；通过网络药理学构建淡附片“成分-靶点-通路”的网络，分析淡附片Q-Marker。通过网络药理学分析获得淡附片治疗心肾阳虚型CHF的可能靶点和信号通路。大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、淡附片0.7、1.4、2.8 g/kg组、心宝丸0.2 g/kg组。采用阿霉素和氢化可的松联用构建心肾阳虚型CHF大鼠模型，给药10 w后，进行血流动力学测定；取血测定血清中脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)和炎症因子含量；Masson、醋酸铀和柠檬酸铅染色观察心肌组织形态学及线粒体超微结构改变，计算胶原容积分数；流式细胞术检测心肌中巨噬细胞相对含量及M1/M2极化状态；实时定量PCR法测定心肌组织中巨噬细胞极化标志物[CD86、CD206、精氨酸酶-1(Arg1)、诱导型一氧化氮合成酶(Inos)]、心脏纤维化标志物[Ⅰ型胶原纤维(Coll I)、Coll III、α-平滑肌肌动蛋白(Asma)]、Il17a、白细胞介素-17受体A(Il17ra)、核转录因子-κB(Nfkb)活化因子1(Act1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(Traf6)mRNA表达；Western blot法测定心脏组织中Coll I、Coll III、α-SMA、IL-17A、IL-17RA、Act1、TRAF6、胞核NF-κB p65、胞浆NF-κB p65、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-P38MAPK)蛋白的表达。结果:建立了淡附片HPLC指纹图谱，成功指认出了26个共有色谱峰，通过对照品比对，确定了苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、大豆苷、黄豆黄苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、甘草酸、甘草苷10种化学成分，其相似度评价结果在0.839～0.984之间；网络药理学预测并筛选了苯甲酰新乌头原碱、甘草酸、大豆苷3种成分作为淡附片Q-Marker。淡附片治疗心肾阳虚型CHF的关键靶点是肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子受体(EGFR)、热休克蛋白90A型1(HSP90AA1)、单胺氧化酶A(MAOA)等。通过GO和KEGG通路富集分析发现，白介素-17(IL-17)、环磷酸腺苷(cAMP)等信号通路与心肾阳虚型CHF密切相关。动物实验结果显示，与模型对照组相比，淡附片0.7、1.4、2.8 g/kg组及心宝丸0.2 g/kg组能有效改善心肾阳虚型CHF大鼠心功能，降低血清中BNP、cTnI和IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、TNF-α含量，下调心脏组织中Coll I、Coll III和Asma mRNA和蛋白表达；升高血清IL-4、IL-10含量；改善心脏病理损伤程度，降低心肌胶原容积分数，减轻线粒体损伤；降低心脏组织中F4/80~+CD86~+ M1细胞百分率和Cd86、Inos mRNA表达，升高F4/80~+CD206~+ M2细胞百分率，上调Cd206、Arg1 mRNA表达；下调心脏组织中Il17a、Il17ra、Act1、Traf6 mRNA表达和IL-17A、IL-17RA、Act1、TRAF6、胞核NF-κB p65、p-P38MAPK蛋白表达，上调胞浆NF-κB p65蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论:建立的淡附片HPLC指纹图谱、多成分含量测定及质量标志物的预测方法简单、准确、重复性好，可用于淡附片的质量评价；结合网络药理学研究发现的苯甲酰新乌头原碱、甘草酸、大豆苷3种成分可作为其Q-Marker;本研究初步揭示淡附片的活性成分与心肾阳虚型CHF的关键蛋白之间存在一定关系，通过多靶点、多通路的综合调控网络发挥治疗心肾阳虚型CHF的作用，其作用机制可能与抑制IL-17信号通路及炎症因子生成有关。
关键词：淡附片;;HPLC指纹图谱;;网络药理学;;质量标志物;;心肾阳虚型慢性心力衰竭;;IL-17信号通路
基金资助：湖北民康制药有限公司合作项目(编号：SDHZ2021133);; 湖北省科技厅自然科学基金项目(编号：2023AFB600、2022CFB357、2022CFB427);; 湖北省卫生健康委员会中医药重点项目(编号：ZY2023Z015)
