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作者：贾茗棪;梁瀛今;井芃祯;王海峰;
单位：河南中医药大学第一附属医院呼吸科;河南中医药大学第一临床医学院;呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心;河南中医药大学第一附属医院中药药理(呼吸)实验室;
摘要：目的:探究清肺解毒化痰方经mTOR/Beclin1/LC3轴改善体外肺泡巨噬细胞重型炎症模型的自噬机制。方法:用肺炎克雷伯杆菌来源LPS刺激小鼠肺泡巨噬细胞MH-S建立体外重型炎症模型。分为空白对照组、模型对照组、43 g/kg清肺解毒化痰方含药血清20%组、雷帕霉素50 nmol/L组、清肺解毒化痰方含药血清20%+雷帕霉素50 nmol/L组、莫西沙星5μg/mL组。细胞培养12 h后，取上清液及细胞，ELISA法检测MH-S细胞培养液上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-33、干扰素-γ(IFN-γ)含量；CCK-8法检测细胞存活率；qPCR法检测细胞Tnfa、Il1b、Il6 mRNA表达；透射电镜观察MH-S细胞自噬情况；MDC法检测MH-S细胞自噬荧光表达；Western blot法检测MH-S细胞中哺乳动物磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、mTOR、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(BECLIN1)表达；免疫荧光观察MH-S细胞中p-MTOR、BECLIN1、LC3蛋白荧光表达水平。结果:与空白对照组相比，模型对照组细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-33和IFN-γ含量升高(P<0.01),电镜显示细胞线粒体肿胀，有空泡病变，内嵴断裂或减少，细胞器减少，线粒体附近出现明显自噬体溶酶体结构，MDC染色细胞自噬荧光表达显著增强(P<0.01),p-mTOR/mTOR蛋白比值降低和p-mTOR荧光表达水平下降，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白上调，LC3、BECLIN1荧光表达水平升高(P<0.05);与模型对照组比较，43 g/kg清肺解毒化痰方20%含药血清组、莫西沙星组细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-33和IFN-γ含量显著降低，自噬体溶酶体数量减少，细胞自噬荧光减弱，p-mTOR/mTOR蛋白表达上调，p-mTOR荧光表达水平升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表达上调，LC3、BECLIN1荧光表达水平降低(P<0.01);经雷帕霉素干预后上述炎症因子含量升高(P<0.05),细胞自噬增强(P<0.01),p-mTOR/mTOR蛋白表达下调，p-mTOR荧光表达水平降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表达上调，LC3、BECLIN1荧光表达水平升高(P<0.05);与雷帕霉素50 nmol/L组相比，43 g/kg清肺解毒化痰方20%含药血清+雷帕霉素50 nmol/L组上述炎症因子含量降低(P<0.05),细胞自噬减弱(P<0.01),p-mTOR/mTOR蛋白表达上调，p-mTOR荧光表达水平升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表达下调，LC3、BECLIN1荧光表达水平降低(P<0.05)。结论:清肺解毒化痰方能减轻重型炎症反应，机制可能与激活mTOR/Beclin1/LC3轴，抑制肺泡巨噬细胞过度自噬有关。
关键词：清肺解毒化痰方;;重症肺炎;;重型炎症;;肺泡巨噬细胞自噬;;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/肌球蛋白样BCL2结合蛋白/微管相关蛋白1轻链3
基金资助：国家自然科学基金项目(编号：82074411、81774222);; 河南省中医药科学研究重大专项(编号：20-21ZYZD04);; 河南省高校科技创新团队支持计划(编号：22IRTSTHN029);; 河南中医药大学“双一流”创建工程中医学学科项目呼吸疾病中医药防治科技创新团队(编号：HSRP-DFCTCM-T-1);; 河南省科技研发计划联合基金(优势学科培育类)项目(编号：232301420084)
