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作者：陈飞飞;郑永智;吴素芳;康乾;晋春阳;
单位：河南省胸科医院结核病科;河南省中医院关节科;
摘要：目的:探讨活性氧(reactive oxygen species, ROS)/蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)信号通路对卡介苗(BCG)感染引起的RAW264.7小鼠巨噬细胞铁死亡的调控作用。方法:采用铁死亡螯合剂去铁胺(deferoxamine, DFO)研究铁死亡在BCG感染诱导细胞死亡中的作用，将RAW264.7细胞分为对照组、BCG组、DFO组、BCG+DFO组；采用PERK抑制剂GSK2606414研究PERK信号通路在BCG感染诱导细胞铁死亡中的作用，将RAW264.7细胞分为对照组、BCG组、GSK2606414组、BCG+GSK2606414组；采用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)观察ROS在调控PERK中的作用，将RAW264.7细胞分为对照组、BCG组、NAC组和BCG+NAC组。通过比色法检测细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放率、Fe~(2+)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)及脂质过氧化水平；通过蛋白免疫印迹法检测谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)、磷酸化PERK(p-PERK)、活化转录因子4(activating transcription factor 4, ATF4)及C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)表达水平；通过流式细胞术检测ROS含量；通过免疫荧光法检测p-PERK蛋白水平；通过菌落形成单位(colony-forming unit, CFU)实验计算BCG在细胞内的存活。结果:与BCG组比较，BCG+DFO组细胞存活率[(84.72±3.62)%vs.(58.41±2.73)%]、GSH水平[(8.85±0.54)μmol/mg vs.(4.81±0.36)μmol/mg]和GPX4蛋白相对表达水平(0.82±0.06 vs. 0.33±0.03)升高(t=-4.263,P=0.004;t=-10.116,P<0.001;t=-10.519,P<0.001),LDH释放率[(15.70±3.18)%vs.(56.24±4.98)%]、Fe~(2+)含量[(8.15±0.64)μmol/mg vs.(18.68±1.27)μmol/mg]和脂质过氧化水平[(22.18±2.24)%vs.(58.13±4.47)%]均明显降低(t=35.982,P<0.001;t=20.203,P<0.001;t=32.528,P<0.001)。与BCG组比较，BCG+GSK2606414组细胞中p-PERK蛋白相对表达水平(0.23±0.02 vs. 0.69±0.04)、ATF4蛋白相对表达水平(0.39±0.02 vs. 0.91±0.06)和CHOP蛋白相对表达水平(0.24±0.03 vs. 0.61±0.04),以及Fe~(2+)[(11.70±0.91)μmol/mg vs.(17.92±1.22)μmol/mg]和脂质过氧化[(19.17±1.75)%vs.(53.28±3.01)%]水平均明显降低(t=17.177,P<0.001;t=21.024,P<0.001;t=19.358,P<0.001;t=11.999,P<0.001;t=30.292,P<0.001),细胞中GPX4蛋白相对表达水平(0.57±0.04 vs. 0.20±0.02)和GSH水平[(8.15±0.47)μmol/mg vs.(4.69±0.22)μmol/mg]则明显升高(t=-15.044,P<0.001;t=-9.316,P<0.001)。此外，BCG感染GSK2606414处理后的巨噬细胞，其24 h和48 h的菌载量[(1.72±0.15)×10~5 CFU和(1.48±0.12)×10~5 CFU]较BCG组[(3.51±0.28)×10~5 CFU和(2.94±0.21)×10~5 CFU]明显降低(t=17.576,P<0.001;t=15.225,P<0.001)。与BCG组(3.24±0.14)比较，BCG+NAC组细胞中的相对ROS水平(1.59±0.11)明显降低(t=20.215,P<0.001)。BCG感染NAC处理后的巨噬细胞，其24 h和48 h的菌载量[(0.91±0.12)×10~5 CFU和(0.80±0.13)×10~5 CFU]较BCG组[(2.18±0.18)×10~5 CFU和(2.37±0.21)×10~5 CFU]明显降低(t=16.672,P<0.001;t=20.630,P<0.001)。结论:BCG感染诱导的巨噬细胞铁死亡与ROS/PERK信号的激活有关。
关键词：分枝杆菌,结核;;巨噬细胞;;铁死亡;;活性氧
基金资助：河南省教育厅项目(23A360023)~~
