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作者：张春;苏丛;伍婷;朱立雨;
单位：安徽医科大学附属巢湖医院感染病科;安徽医科大学第一附属医院感染管理科;安徽医科大学第一附属医院感染病科;安徽省细菌耐药性监控中心;安徽医科大学细菌耐药研究所;
摘要：目的 构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统，并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达，为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段，将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体；PCR鉴定重组质粒，将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞，氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株；Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株；感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后，RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果 通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上，并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功；挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株，Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株；感染K.p.后，高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论 经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株，为后续p62基因的研究提供了基础。
关键词：P62;慢病毒载体构建;三质粒包装系统;THP-1细胞;肺炎克雷伯菌;过表达
基金资助：国家自然科学基金(编号：82100017); 安徽省卫生健康科研项目(编号：AHWJ2022b076)
