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作者：陈星;周哲旭;尚艺婉;刘洋;刘娅茹;胡啸博;菅佳宁;肖小乔;陈玉龙;
单位：河南中医药大学,河南省中医方证信号传导重点实验室;
摘要：目的 探索六君子汤乙酸乙酯提取物(EAELD)能否通过miR-1/HIF-1α轴调控食管癌细胞TE-1的能量代谢及其分子机制。方法 前期实验已建立稳定转染阻滞miR-1表达细胞株(IN)及空白对照(NC),采用MTT法得到EAELD对NC的半数抑制浓度(IC_(50))及30%抑制浓度(IC_(30)),将其作为六高、六低浓度分别作用于IN与NC进行对比。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测EAELD对于TE-1细胞miR-1、HIF-1α mRNA的影响。双荧光素酶基因报告实验验证miR-1、HIF-1α靶向关系。然后将实验分组为NC组、六低组、六高组、IN+六低组、IN+六高组，Seahorse能量代谢分析系统检测线粒体压力与糖酵解速率，蛋白免疫印迹法(WB)检测能量代谢相关分子蛋白表达水平变化。结果 MTT结果显示EAELD能够显著抑制NC增殖能力，呈浓度梯度依赖，选取20μg/mL(IC_(30))、40μg/mL(IC_(50))为低、高浓度组。RT-qPCR结果显示EAELD高浓度组显著促进miR-1的基因表达(P<0.05),HIF-1α有下降趋势，差异无统计学意义。双荧光素酶基因报告实验显示与野生型(WT)+阴性对照(mimics NC)组相比，WT+mimics荧光强度明显下降(P<0.05),与突变型(MUT)+阴性对照(mimics NC)组相比，MUT+mimics荧光强度无明显差别。将高、低浓度EAELD作用于IN时，MTT结果显示与NC相比，EAELD对于IN的抑制作用显著降低(P<0.05)。Seahorse能量代谢结果显示与NC组相比，EAELD高、低浓度组均可以抑制线粒体耗氧与糖酵解的比值(P<0.01,P<0.05)、糖酵解潜能(P<0.01)、基础呼吸值、质子漏耗氧(P<0.01,P<0.05)、线粒体最大耗氧能力、备用呼吸能力(P<0.01),高浓度组可以抑制基础糖酵解、补偿糖酵解、非线粒体耗氧、ATP合成耗氧(P<0.01)。与NC+六低组相比，IN+六低组的基础糖酵解、线粒体与基础糖酵解的比值、糖酵解潜能(P<0.05)、ATP合成耗氧(P<0.01)显著升高；与NC+六高组相比，IN+六高基础糖酵解、补偿糖酵解(P<0.05)、基础呼吸能力、质子漏耗氧、线粒体最大耗氧量、非线粒体耗氧显著升高(P<0.01)。WB结果显示与NC相比，EAELD高、低浓度组可以显著降低HK2(P<0.01)、GLUT1(P<0.05、P<0.01)、MCT1(P<0.01、P<0.05)蛋白相对表达量，高浓度组可以显著抑制PKM2(P<0.05)、MCT2、MCT4(P<0.01)的蛋白相对表达量；与NC+六低组相比，IN+六低组HK2、GLUT1、PKM2(P<0.01)、p-PKM2、MCT1、MCT2(P<0.05)的表达明显升高，与NC+六高组相比，IN+六高组可以显著促进HK2、GLUT1、PKM2、MCT4的表达(P<0.05)。结论 六君子汤乙酸乙酯提取物可以通过下调能量代谢相关分子GLUT1、PKM2、p-PKM2、HK2、MCT1、MCT2、MCT4的蛋白表达抑制食管癌细胞TE-1的能量代谢，其部分机制与miR-1/HIF-1α轴有关。
关键词：六君子汤乙酸乙酯提取物;食管癌;能量代谢;miR-1/HIF-1α轴;分子机制
基金资助：国家自然科学基金项目(82074313)
