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作者：曹珊;张艺嘉;白杨;陈芳;谢莎;韩倩倩;
单位：河南中医药大学中医学院方剂教研室;河南中医药大学教务处;河南中医药大学研究生院;河南中医药大学医学院病理生理学教研室;河南中医药大学基础实验中心;
摘要：目的：利用网络药理学分析方法初步预测消斑通脉方抗动脉粥样硬化（AS）的潜在作用通路和靶点，联合体外细胞实验对其可能机制进行验证。方法：采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、GeneCards、Swiss Target Prediction和Uniprot等数据库，收集消斑通脉方中活性化合物及对应靶点信息，构建“成分-靶点-疾病”网络，通过蛋白-蛋白互作（PPI）网络预测可能的作用靶点和通路，对交集靶点进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。体外培养人主动脉血管平滑肌细胞（HA-VSMCs）并鉴定，采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导HA-VSMCs异常增殖并进行鉴定。MTT法检测不同浓度消斑通脉方作用后各组HA-VSMCs增殖活性，确定消斑通脉方安全性。HA-VSMCs分为空白组、模型组（诱导HA-VSMCs异常增殖）、瑞舒伐他汀组（诱导HA-VSMCs异常增殖后采用4μmol·L~(-1)瑞舒伐他汀干预）及低、中和高剂量消斑通脉方组（诱导HA-VSMCs异常增殖后分别采用0.025、 0.050和0.100 mg·L~(-1)消斑通脉方干预）。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组HA-VSMCs培养上清中人单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、白细胞介素6 (IL-6)和白细胞介素8 (IL-8)水平，实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组HA-VSMCs中核因子κB (NF-κB) p65 mRNA和成纤维细胞生长因子2(FGF2) mRNA表达水平，Western blotting法检测各组HA-VSMCs中NF-κB p65和FGF2蛋白表达水平。结果：消斑通脉方中含有103种活性成分，可通过作用于189个靶基因发挥抗AS作用，潜在作用靶点包括IL-6、IL-8、血管内皮生长因子A (VEGFA)、核因子κB1 (NF-κB1)和RELA (NF-κB p65)等。GO功能分析和KEGG信号通路富集分析，消斑通脉方通过调节脂质、缺氧诱导因子1(HIF-1)、表皮生长因子（EGF）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)和NF-κB等信号通路发挥抗AS作用。细胞形态表现和免疫荧光染色结果证明细胞为HA-VSMCs。油红O染色，可观察到大量红色脂滴，表明造模成功。MTT法检测，在一定剂量范围内消斑通脉方对HA-VSMCs增殖率无明显影响，安全性良好。ELISA法检测，与模型组比较，瑞舒伐他汀组和不同剂量消斑通脉方组HA-VSMCs培养上清中MCP-1和IL-6水平降低（P<0.05或P<0.01）,0.050和0.100 mg·L~(-1)消斑通脉方组HA-VSMC培养上清中IL-8降低（P<0.01）；与瑞舒伐他汀组比较，不同剂量消斑通脉方组HA-VSMCs培养上清中MCP-1降低（P<0.01）,0.050和0.100 mg·L~(-1)消斑通脉方组HA-VSMCs培养上清中IL-8降低（P<0.01）。与模型组比较，瑞舒伐他汀组和不同剂量消斑通脉方组HA-VSMCs中NF-κB p65 mRNA表达水平降低（P<0.01），瑞舒伐他汀组及0.050和0.100 mg·L~(-1)消斑通脉方组HA-VSMCs中FGF2 mRNA表达水平降低（P<0.01）；与瑞舒伐他汀组比较，0.050和0.100 mg·L~(-1)消斑通脉方组HA-VSMCs中NF-κB p65和FGF2 mRNA表达水平降低（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，瑞舒伐他汀组和不同剂量消斑通脉方组HA-VSMCs中NF-κB p65和FGF2蛋白表达水平降低（P<0.01）；与瑞舒伐他汀组比较，0.050和0.100 mg·L~(-1)消斑通脉方组HA-VSMCs中NF-κB p65蛋白表达水平降低（P<0.01）,0.100 mg·L~(-1)消斑通脉方组HA-VSMCs中FGF2蛋白表达水平降低（P<0.01）。结论：消斑通脉方具有抗炎、抑制HA-VSMCs增殖和抗AS作用，其作用机制可能与NF-κB/FGF2通路失活有关。
关键词：消斑通脉方;;动脉粥样硬化;;血管平滑肌细胞;;网络药理学;;细胞增殖
基金资助：河南省科技厅科技攻关项目（232102310434）;河南省科技厅面上科学基金项目（242300421295）;; 河南省卫健委中医药科学研究重大专项项目（2022ZYZD20）;河南省卫健委中医药科学研究重点项目（2023ZY1031）;; 崔应民全国名老中医药专家传承工作室建设项目（国中医药人教函[2022] 75号）
