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作者：阎希芮;王艺蓉;楚敏;刘晴;施建蓉;董杨;
单位：上海中医药大学中西医结合学院;上海中医药大学中医学院;
摘要：目的 在耳蜗基底膜离体培养模型上，观察D-半乳糖对小鼠耳蜗基底膜毛细胞的作用，并从自噬和凋亡途径进一步探讨其分子机制。方法 选取SPF级3～4 d龄Wistar大鼠132只(264个耳蜗)体外培养3～4 d龄Wistar大鼠耳蜗基底膜，用100 mmol/L、300 mmol/L、500 mmol/L D-半乳糖处理24 h，将大鼠分为对照组、100 mmol/L D-半乳糖组、300 mmol/L D-半乳糖组和500 mmol/L D-半乳糖组，每组24只(48个耳蜗)。P53抑制剂Pifithrin-α(PFT-α)实验分为对照组、300 mmol/L D-半乳糖组、50μmol/L PFT-α组、300 mmol/L D-半乳糖+50μmol/L PFT-α组，每组9只(18个耳蜗)。采用Alexa Fluo 555-鬼笔环肽标记，进行全耳蜗毛细胞计数和定量分析。Western blot分析耳蜗基底膜自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62、Beclin-1，细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、CleavedCaspase-3以及p53蛋白的表达。免疫荧光定位检测耳蜗基底膜毛细胞上p53、LC3-Ⅱ、p62和CleavedCaspase-3的蛋白表达变化。用p53抑制剂PFT-α抑制p53蛋白表达，检测下游蛋白LC3-Ⅱ、p62和Cleaved Caspase-3表达的变化。结果D-半乳糖可导致耳蜗基底膜毛细胞损伤和缺失，并随剂量增加而加重。Western blot结果显示，D-半乳糖可增加耳蜗基底膜p53、LC3-Ⅱ、p62和Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平以及Bax/Bcl-2的比值，降低Beclin-1的表达，且呈一定剂量依赖性。免疫荧光结果显示，D-半乳糖可增强耳蜗基底膜毛细胞上p53、LC3-Ⅱ、p62和Cleaved Caspase-3蛋白表达。P53抑制剂PFT-α可以抑制D-半乳糖引起的p53、p62和Cleaved Caspase-3蛋白表达的增高，但可以进一步升高LC3-Ⅱ蛋白表达。结论 D-半乳糖可通过p53调节自噬和凋亡诱导体外培养的耳蜗基底膜毛细胞损伤。
关键词：老年性聋;;D-半乳糖;;自噬;;凋亡;;p53
基金资助：国家自然科学基金(81774020);; 上海中医药大学预算内项目(2021LK030);; 上海市卫健委上海市进一步加快中医药事业发展三年行动计划项目[ZY(2021-2023)-0208]
