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作者：付双双;常晓;倪荣融;王泽轩;颜可欣;孙文庆;武鑫和;吴澳迪;张雨晨;张玉婷;袁静;顾茂源;王月丽;孟闯;易继海;哈依拉提·居马诺夫;
单位：动物生物医药兵团重点实验室;石河子大学动物科技学院;石河子大学医学院;扬州大学江苏省人兽共患病重点实验室;哈萨克国立农业大学;
摘要：为了制备布鲁氏菌铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)蛋白多克隆抗体并建立间接ELISA方法，试验将布鲁氏菌Cu/Zn-SOD基因克隆至原核表达载体p ET-22b(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导，采用His标签镍柱亲和层析法纯化重组蛋白Cu/Zn-SOD，将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔4次，获得抗Cu/Zn-SOD的多克隆抗体;将重组蛋白Cu/Zn-SOD作为包被抗原，建立检测布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法，评估其特异性、敏感性和重复性，并对采集的羊血清样品进行检测。结果表明:重组蛋白Cu/Zn-SOD主要以包涵体形式表达，纯化后在18.95 ku处出现明显单一条带，并且能与布鲁氏菌标准阳性血清发生特异性结合。制备的重组蛋白Cu/Zn-SOD兔多克隆抗体经Western-blot鉴定，能特异性识别布鲁氏菌的Cu/Zn-SOD蛋白，抗体效价大于1∶204 800。经过条件优化，确定间接ELISA的最佳抗原包被浓度为2μg/m L，最佳封闭液为5%脱脂奶粉，最佳封闭时间为2 h，一抗最佳稀释度为1∶200，最佳孵育时间为1 h，二抗最佳稀释度为1∶8 000，最佳孵育时间为1 h，显色时间为15 min。该检测方法批内、批间重复试验的变异系数均小于7%;且仅能检测布鲁氏菌标准阳性血清，无法检测巴氏杆菌、沙门菌、大肠杆菌和小肠耶尔森氏菌阳性血清;当布鲁氏菌阳性血清稀释度为1∶3 200时，检测结果仍然为阳性，具有较好的重复性、特异性和敏感性;在临床应用评估中，该方法检测的阳性率为27.12%，与虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)及布鲁氏菌抗体检测试剂盒的符合率大于92%。说明成功表达了Cu/Zn-SOD蛋白，所制备的多克隆抗体能与布鲁氏菌和Cu/Zn-SOD蛋白发生特异性反应，建立的间接ELISA方法具有较高的特异性、敏感性和良好的重复性。
关键词：布鲁氏菌;;铜锌超氧化物歧化酶;;重组蛋白;;多克隆抗体;;间接ELISA
基金资助：江苏省人兽共患病学重点实验室开放课题(R2104);; 八师石河子市科技计划项目(2024SF101);; 兵团区域创新引导计划项目(2023ZD065);; 动物生物医药兵团重点实验室开放课题(FM0F2023001)
