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作者：陆泳锟;张德雄;王晓虎;陈晶;黄元;马惠海;李学泓;陈翔宇;黄淑坚;王刚;
单位：佛山大学动物科技学院;广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测研究站;仲恺农业工程学院动物科技学院;吉林省农业科学院(中国农业科技东北创新中心)畜牧兽医分院;鹤山市旺牛世家农业科技有限公司;
摘要：为建立一种可快速、特异、高效检测牛肠道病毒（Bovine enterovirus,BEV）的实时荧光定量PCR检测方法，本研究根据GenBank数据库BEV流行毒株5’UTR保守基因序列设计合成特异性引物及探针，并以BEV阳性核酸5’UTR基因序列构建的标准质粒为模板，采用矩阵法对引物和探针浓度、退火温度进行优化及绘制标准曲线，同时进行灵敏性、重复性及特异性验证和临床样本检测。结果表明，该检测方法在重组质粒标准品模板浓度为4.05×10~2～4.05×10~9拷贝/μL范围内呈现良好的线性关系，相关系数R~2为0.9975，线性方程斜率为3.4539，扩增效率为94.7%，最低检测限度为4.05×10~2拷贝/μL，比常规RT-PCR检测方法灵敏度高100倍；组内和组间的变异系数均小于0.8%；与牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea mucosal disease virus,BVDV）、轮状病毒（Rotavirus,RV）、牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）和牛流行热病毒（Bovine ephemeral fever virus,BEFV）均无交叉反应。应用该检测方法对牛场采集的36份腹泻牛的粪便样品和24份肛拭子样品进行检测，检测阳性率分别为94.44%(34/36)和91.67%(22/24)。经试验验证表明，该检测方法具有较好的灵敏性、重复性及特异性，可应用于牛常规临床样本中BEV的鉴别诊断，为BEV的防控提供了有力的技术支持。
关键词：牛肠道病毒;;5’UTR基因;;TaqMan探针法;;实时荧光定量PCR
基金资助：广东省农村科技特派员重点派驻任务项目(项目号：KTP20240431),题目：肉牛健康养殖与疫病防控技术应用推广;; 广州市科技计划项目(项目号：2023B04J0137),题目：广州市动物疫病分子流行病学监测与防控技术研究;; 广东省科技计划项目(项目号：2023A1111110001),题目：广东省重大动物疫病防控关键技术研发;; 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室(项目号：2023B1212060040),题目：畜禽新发及重大疫病监测与防控机制研究;; 广东省动物疫病野外科学观测研究站(项目
