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作者：邵文华;杨帆;曹伟军;陈创伟;王伟;郑海学;张伟;朱紫祥;赵宗胜;
单位：石河子大学动物科技学院;中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室;甘肃省病原生物学基础学科研究中心;
摘要：本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了TRAF3基因敲除的PK-15细胞模型，该模型为阐明TRAF3在口蹄疫病毒（FMDV）复制中的调控作用提供试验材料。针对猪TRAF3基因的编码区序列，设计并筛选出2条高效特异的单向导RNA(sgRNA)，并将其分别克隆至CRISPR/Cas9载体pX459中。通过脂质体介导的转染技术将重组质粒导入PK-15细胞后，采用嘌呤霉素梯度筛选和有限稀释法相结合的策略，成功获得单克隆细胞系。采用DNA测序结合蛋白质免疫印迹技术对构建的细胞系进行验证，结果显示，TRAF3基因存在特异性碱基缺失突变，且未检测到相应蛋白表达，由此确认TRAF3基因敲除细胞模型构建成功。为探究该基因缺失对FMDV复制的调控作用，通过Western-blot、实时定量PCR(RT-qPCR)及半数组织培养感染剂量（TCID_(50)）等多维度检测发现，TRAF3基因的稳定敲除可增强FMDV的复制能力。本研究结果不仅为阐明TRAF3的生物学功能提供了工具细胞系，更为后续研究该基因在病毒-宿主相互作用中的分子机制奠定了基础。
关键词：CRISPR/Cas9;;TNF受体关联蛋白3;;细胞系;;口蹄疫病毒
基金资助：国家自然科学基金项目（32473064）;; 国家重点研发计划项目（2021YFD1800302）;; 兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金（lzujbky-2022-ey20）;; 国家生猪产业技术体系项目（CARS-35）;; 国家生猪技术创新中心项目（NCTIPXD/C03）;; 甘肃省自然科学基金项目（23JRRA547）
