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作者：陈创伟;张伟;邵文华;吴魏;牛艺璇;刘泓屹;赵晓义;曹伟军;郑海学;杨帆;
单位：中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室;甘肃省病原生物学基础学科研究中心;
摘要：旨在探索Kelch样蛋白34(KLHL34)对水疱性口炎病毒（VSV）复制和Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）信号通路下游干扰素刺激基因（ISGs）转录的影响。首先，扩增KLHL34基因，构建重组质粒，并与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装，然后将包装好的慢病毒感染HEK-293T细胞，并通过嘌呤霉素筛选获得过表达KLHL34基因的阳性细胞系，经荧光显微镜观察，用蛋白免疫印迹（Western-blot）、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和病毒滴度测定（TCID_(50)）等方法，比较VSV在过表达KLHL34/HEK-293T细胞系和野生型HEK-293T细胞中的复制差异，并分析过表达KLHL34基因对VSV诱导的IFN-Ⅰ和ISGs的影响。结果表明，经双酶切和测序鉴定，慢病毒表达质粒pLV-puro-3×Flag-KLHL34成功构建；内外源Western-blot验证了在70 kDa左右KLHL34蛋白的表达，即过表达KLHL34/HEK-293T细胞系成功建立；而后，荧光图像、Western-blot、RT-qPCR及TCID_(50)显示，在过表达KLHL34/HEK-293T细胞系中，VSV的复制能力显著降低，且该细胞系在VSV诱导下ISGs的转录水平较野生型HEK-293T细胞显著升高。本研究构建的过表达KLHL34/HEK-293T细胞系能显著抑制VSV的增殖并促进IFN-Ⅰ信号通路，为深入研究KLHL34的功能及其在抗病毒天然免疫信号通路中的作用提供了生物材料。
关键词：Kelch样蛋白34;;水疱性口炎病毒;;慢病毒包装;;过表达细胞系;;干扰素
基金资助：甘肃省科技重大专项计划项目（22ZD6NA001）;; 兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金项目（lzujbky-2025-it58）;; 甘肃省联合科研基金项目（25JRRA1088,25JRRA1087）;; 国家生猪产业技术体系项目（CARS-35）;; 国家生猪技术创新中心项目（NCTIP-XD/C03）
