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作者：左妤祺;周学慧;郁蕾;刘霞;徐婷婷;焦震浩;刘言言;尚佳富;杨晓伟;倪兴维;王艳;赵光伟;
单位：西南大学动物医学院;上海海关动植物与食品检验检疫技术中心;贵州省动物疫病预防控制中心;
摘要：为建立赤羽病病毒（AKAV）的间接免疫荧光检测方法（IFA），本试验利用大肠杆菌原核表达系统将AKAV的N蛋白进行表达，蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体，以AKAV感染后的BHK-21细胞作为抗原，小鼠抗N蛋白多克隆抗体为一抗，FITC-山羊抗小鼠Ig G为二抗，建立AKAV的IFA检测方法，优化筛选抗体的最佳孵育浓度和孵育时间，评估所建立方法的特异性、敏感性和重复性。最后，利用该方法对临床样品进行检测，并与荧光定量PCR方法进行符合性验证。结果显示，N蛋白可在大肠杆菌中高效表达，4次免疫小鼠后多克隆抗体效价可达1∶51 200；经优化筛选，在一抗稀释浓度1∶200、孵育2 h，二抗稀释浓度1∶500、孵育1.5 h条件下，IFA检测效果最佳；敏感性试验显示，所建方法对25 TCID_(50)的AKAV可有效检出；特异性试验显示与其他病原无交叉反应，且重复性良好。该方法对24份临床山羊血液样本进行检测，共检出8份阳性、16份阴性样本，与荧光定量PCR方法检测结果相比，二者的符合率为95.8%。本试验为AKAV实验室诊断技术及产品的开发提供了技术支持，同时为深入研究AKAV感染机制奠定了基础。
关键词：赤羽病病毒;;多克隆抗体;;间接免疫荧光;;检测方法;;N蛋白
基金资助：中央引导地方科技发展资金项目（2024ZY0156）;; 贵州省科技支撑项目（黔科合支撑[2023]一般022）
