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作者：蔡鑫;姚晓慧;聂万森;杜汉宇;周黎笋;李宗杰;魏建超;刘珂;邵东华;邱亚峰;马志永;李蓓蓓;夏利宁;
单位：新疆农业大学动物医学学院;中国农业科学院上海兽医研究所;
摘要：基于细菌青霉素结合蛋白(PBP)与碳青霉烯药物完整结构和水解产物的亲和力差异极大的原理，建立一种新型的筛选碳青霉烯酶NDM-1抑制剂的ELISA方法。BSA与美罗培南的偶联物(BSA-MEM)包被于ELISA板封闭后，将待筛化合物与NDM-1蛋白同时加入反应，随后加入生物素标记的PBP蛋白(PBP-BIO)，PBP-BIO可与未被水解的BSA-MEM进行结合，通过生物素-链霉亲和素系统产生的信号来表征结合的PBP蛋白以及未被水解的BSA-MEM的量，从而间接指征待筛化合物对NDM-1是否有抑制活性。通过原核表达系统，表达纯化碳青霉烯酶NDM-1，利用EDC偶联法和生物素标记法，制备BSA-MEM和PBP-BIO的偶联物，采用棋盘滴定法确定BSA-MEM量、NDM-1、待筛化合物和PBP-BIO的最佳工作浓度和反应时间等参数，并利用该方法对FDA批准药物库中的300余种化合物进行初步筛选。结果显示，最佳ELISA方案为：BSA-MEM偶联物包被量为1 μg、100 μL/孔；封闭液为1%的牛血清白蛋白，作用时间为2 h；NDM-1使用量为4 μg；待筛化合物的使用浓度为30 μmol/L，反应时间为15 min；PBP-BIO稀释度为1:1000，反应时间为15 min；SA-HRP作用时间为30 min，稀释度为1:3000；TMB显色时间为15 min。利用上述建立的ELISA方法，成功从FDA批准药物库中筛选到两个潜在的NDM-1抑制剂。本研究成功建立了一种新型的NDM-1抑制剂的ELISA筛选方法，具有快速和高通量的优点，为NDM-1抑制剂的筛选提供了新方法和新思路。
关键词：碳青霉烯酶;;NDM-1;;ELISA;;抑制剂;;高通量筛选
基金资助：上海市科技兴农技术创新项目(沪农科创字(2022)第2022-02-08-00-12-F01100号)
