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作者：陈程;李警耀;胡万祥;刘东慧;陈志宏;
单位：承德医学院基础医学院生理学教研室;承德医学院基础医学院人体解剖学教研室;军科正源(天津)生物医药科技有限公司;
摘要：目的：探讨丝胶对链脲佐菌素（STZ）致损伤INS-1细胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B (Akt)/核因子κB (NF-κB)信号通路和细胞凋亡的影响，并阐明其作用机制。方法：采用含0、0.1、0.3、1.0、3.0和10.0μmol·L~(-1) Akt1抑制剂A-674563及10 mmol·L~(-1) STZ及600 mg·L~(-1)丝胶的完全培养基培养INS-1细胞，分为0、0.1、0.3、1.0、3.0和10.0μmol·L~(-1) A-674563组，另设置对照组（不含药物的完全培养基），采用细胞计数试剂盒8 (CCK-8)法检测INS-1细胞存活率，并计算半数抑制浓度（IC50）值，筛选A-674563最佳抑制浓度，并采用Western blotting法验证。将INS-1细胞分为正常对照组（完全培养基）、模型组（10 mmol·L~(-1) STZ+完全培养基）、低、中和高剂量丝胶组（10 mmol·L~(-1) STZ+150 mg·L~(-1)丝胶+完全培养基、10 mmol·L~(-1) STZ+300 mg·L~(-1)丝胶+完全培养基和10mmol·L~(-1)STZ+600mg·L~(-1)丝胶+完全培养基），采用CCK-8法检测各组INS-1细胞存活率，筛选丝胶最佳作用浓度。另将INS-1细胞分为正常对照组（完全培养基）、模型组（10 mmol·L~(-1) STZ+完全培养基）、丝胶组（10 mmol·L~(-1) STZ+600 mg·L~(-1)丝胶+完全培养基）和A-674563组（10 mmol·L~(-1) STZ+600 mg·L~(-1)丝胶+0.3μmol·L~(-1) A-674563+完全培养基），采用流式细胞术检测各组INS-1细胞凋亡率，实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组INS-1细胞中Akt1、NF-κB、肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白细胞介素6 (IL-6) mRNA表达水平，Western blotting法检测各组INS-1细胞磷酸化Akt1 (p-Akt1)和NF-κB蛋白表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组INS-1细胞中TNF-α和IL-6水平。结果：对照组INS-1细胞存活率为100.00%±0.00%,0、0.1、0.3、1.0、3.0和10.0μmol·L~(-1) A-674563+10 mmol·L~(-1) STZ+600 mg·L~(-1)丝胶+完全培养基共同作用后INS-1细胞存活率分别为82.50%±2.28%、69.47%±1.94%、51.51%±1.74%、38.94%±1.57%、24.79%±1.14%和19.85%±1.03%。A-674563对INS-1细胞的IC50值为0.3μmol·L~(-1)，选择0.3μmol·L~(-1) A-674563作用INS-1细胞。与0μmol·L~(-1) A-674563比较，0.3μmol·L~(-1) A-674563+10 mmol·L~(-1) STZ+600 mg·L~(-1)丝胶+完全培养基共同作用下，INS-1细胞中p-Akt1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。CCK-8法检测，与正常对照组比较，模型组INS-1细胞存活率明显降低（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量丝胶组INS-1细胞存活率均明显升高（P<0.05）；与低和中剂量丝胶组比较，高剂量丝胶组INS-1细胞存活率明显升高（P<0.05），因此选择600 mg·L~(-1)丝胶作用细胞。与正常对照组比较，模型组INS-1细胞存活率明显降低（P<0.05）；与模型组比较，丝胶组INS-1细胞存活率明显升高（P<0.05）；与丝胶组比较，A-674563组INS-1细胞存活率明显降低（P<0.05）。流式细胞术检测，与正常对照组比较，模型组INS-1细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与模型组比较，丝胶组INS-1细胞凋亡率明显降低（P<0.05）；与丝胶组比较，A-674563组INS-1细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。RT-qPCR法检测，与正常对照组比较，模型组INS-1细胞中Akt1mRNA表达水平明显降低（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量丝胶组INS-1细胞中Akt1mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）；与低和中剂量丝胶组比较，高剂量丝胶组INS-1细胞中Akt1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）。与正常对照组比较，模型组INS-1细胞中NF-κB、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，丝胶组INS-1细胞中NF-κB、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平均明显降低（P<0.05）；与丝胶组比较，A-674563组INS-1细胞中NF-κB mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）。Western blotting法检测，与正常对照组比较，模型组INS-1细胞中p-Akt1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量丝胶组INS-1细胞中p-Akt1蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）；与低和中剂量丝胶组比较，高剂量丝胶组INS-1细胞中p-Akt1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与正常对照组比较，模型组INS-1细胞中NF-κB蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，丝胶组INS-1细胞中NF-κB蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与丝胶组比较，A-674563组INS-1细胞中NF-κB蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。ELISA法检测，与正常对照组比较，模型组INS-1细胞中TNF-α和IL-6水平均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，丝胶组INS-1细胞中TNF-α和IL-6水平均明显降低（P<0.05）；与丝胶组比较，A-674563组INS-1细胞中TNF-α和IL-6水平均明显升高（P<0.05）。结论：丝胶通过靶向Akt1减轻PI3K/Akt/NF-κB信号通路介导的炎症反应和细胞凋亡，对STZ引起的INS-1细胞损伤具有保护作用。
关键词：丝胶;;INS-1细胞;;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/核因子κB信号通路;;炎症反应;;细胞凋亡
基金资助：国家自然科学基金项目（81441133）;; 河北省卫健委医学科学研究项目（20210468）;; 承德医学院国家自然科学基金项目培育基金项目（201912）
