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作者：顾雨玲;郑翠;汤云仙;
单位：南京医科大学附属苏州医院苏州市立医院妇产科;
摘要：目的：探讨沉默生物节律基因TIMELESS (TIM)对卵巢癌细胞免疫逃逸的影响，并阐明其相关作用机制。方法：分离CD8+T淋巴细胞，并采用流式细胞术进行鉴定，检测细胞中CD3+/CD8+细胞亚群比例。体外培养人卵巢癌SK-OV-3细胞，分别转染TIM小干扰RNA(siRNA)干扰质粒（si-TIM）、阴性对照质粒（si-NC）、程序性死亡配体1 (PD-L1)过表达质粒（oe-PD-L1）及其阴性对照质粒（oe-NC），分为空白对照组（BC组，不进行转染）、si-NC组（转染si-NC）、 si-TIM组（转染si-TIM）、 si-NC+oe-NC组（转染si-NC和oe-NC）和si-TIM+oe-PD-L1（转染si-TIM和oe-PD-L1）组。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法和Western blotting法检测SK-OV-3细胞中TIM mRNA及蛋白表达水平，验证TIM基因沉默情况。将转染后的SK-OV-3细胞与激活的CD8+T淋巴细胞共培养，分为BC组（单独培养SK-OV-3细胞）、BC/T组、si-NC/T组、si-TIM/T组、si-NC+oe-NC/T组和si-TIM+oe-PD-L1/T组，采用CCK-8法检测各组SK-OV-3细胞存活率，流式细胞术检测各组SK-OV-3细胞凋亡率和细胞表面PD-L1阳性表达率，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测共培养上清液中干扰素γ (IFN-γ)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)水平，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测各组CD8+T淋巴细胞杀伤力，RT-qPCR法检测各组SK-OV-3细胞中TIM和PD-L1 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组SK-OV-3细胞中TIM和PD-L1蛋白表达水平。结果：免疫磁珠法分离后，CD8+T淋巴细胞（CD3+/CD8+）亚群比例为96.56%±0.59%，提示所提取CD8+T淋巴细胞纯度较高。与BC组比较，si-TIM组细胞中TIM mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01），提示本研究成功获得TIM基因沉默的卵巢癌SK-OV-3细胞。CCK-8法，与BC组比较，BC/T组SK-OV-3细胞存活率明显降低（P<0.01）；与BC/T组比较，si-TIM/T组SK-OV-3细胞存活率明显降低（P<0.01）。流式细胞术，与BC组比较，BC/T组SK-OV-3细胞凋亡率明显升高（P<0.01）；与BC/T组比较，si-TIM/T组SK-OV-3细胞凋亡率明显升高（P<0.01）；与si-TIM/T组比较，si-TIM+oe-PD-L1/T组SK-OV-3细胞凋亡率明显降低（P<0.01）。与BC组比较，si-TIM组SK-OV-3细胞表面PD-L1阳性表达率明显降低（P<0.01）。ELISA法，与BC/T组比较，si-TIM/T组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平均明显升高（P<0.01）；与si-TIM/T组比较，si-TIM+oe-PD-L1/T组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平均明显降低（P<0.01）。LDH释放法，与BC/T组比较，si-TIM/T组CD8+T淋巴细胞杀伤力明显增强（P<0.01）；与si-TIM/T组比较，si-TIM+oe-PD-L1/T组CD8+T淋巴细胞杀伤力明显减弱（P<0.01）。RT-qPCR法和Western blotting法，与BC组比较，si-TIM组SK-OV-3细胞中PD-L1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）；与si-TIM组比较，si-TIM+oe-PD-L1组细胞中PD-L1蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。结论：TIM基因沉默可增强CD8+T淋巴细胞对卵巢癌SK-OV-3细胞的杀伤作用，抑制其免疫逃逸，其作用机制可能与调控PD-L1蛋白表达有关。
关键词：卵巢癌;;免疫逃逸;;TIMELESS基因;;CD8+T淋巴细胞;;程序性死亡配体1
基金资助：江苏省卫健委省妇幼保健科研项目（F202207）
