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作者：陈思宇;张梦洁;田睿;陈益;刘镝钺;李文良;毛立;程子龙;杨蕾蕾;孙敏;张纹纹;杜改梅;储岳峰;王金泉;刘茂军;
单位：新疆农业大学动物医学学院;江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室;金陵科技学院动物科学与食品工程学院;中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室;兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心;
摘要：绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原，危害严重；快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法，利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达，纯化出高纯度重组rEF-Tu蛋白，以纯化的rEF-Tu为包被抗原，建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示，原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 kDa，与预期相符；Western blot证实具有良好的反应原性；建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示，包被抗原浓度为1.25 mg/L，37℃孵育2 h；封闭条件为30 g/L BSA，37℃孵育1 h；待检血清1∶100稀释，37℃孵育45 min；酶标二抗1∶20 000稀释，37℃孵育30 min；底物TMB 37℃避光反应15 min；样品OD_(450)值≥0.296时判定为阳性，OD_(450)值≤0.265时判定为阴性，OD_(450)值0.265～0.296则判为可疑；组内和组间变异系数均低于10%；用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测，两者特异性为90.70%，敏感性为82.69%，符合率约为87.12%。上述结果表明，本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性，为Mo的临床诊断、抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法，也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。
关键词：绵羊肺炎支原体;;EF-Tu蛋白;;原核表达;;间接ELISA
基金资助：国家自然科学基金项目(32202809);; 动物疫病防控全国重点实验室开放基金项目(SKLVEB-KFKT-04)
