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作者：林伟山;韩元;马豆豆;李春花;童生林;李秀萍;雷萌桐;王光华;
单位：青海大学畜牧兽医科学院兽医研究所;青海省动物疾病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室;青海大学生态环境工程学院;
摘要：为了快速、准确地检测牦牛源牛肠道病毒(Bovine enterovirus, BEV),试验根据GenBank中牦牛源BEV-NH2株3D基因序列(登录号为PP746571)设计可用于检测青海牦牛源BEV的实时荧光定量PCR特异性引物，通过构建标准质粒和绘制标准曲线建立牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法，对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验，并分别应用该方法及普通RT-PCR方法对青海省海北地区6个牦牛繁育基地的286份腹泻牦牛粪便样品进行检测，计算两种方法的符合率。结果表明：建立的牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法扩增产物的熔解曲线单一，Tm值在85.6～85.8℃之间，无引物二聚体和非特异性扩增；质粒浓度在3×10~2～3×10~8copies/μL范围内时标准曲线的线性关系良好，Ct值在10.88～29.63之间，回归方程为y=-3.16x+38.01,R~2=0.996 4;仅可检测到牦牛源BEV-NH2株，检测不到牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)MY01株、牛轮状病毒(Bovine rotavirus, BRV)MY20株和牛冠状病毒(Bovine coronavirus, BcoV)QL21株；对牦牛源BEV的最低检测限为3×10~2copies/μL;当模板浓度为3×10~2 copies/μL、3×10~3 copies/μL和3×10~7 copies/μL时，Ct值的变异系数分别为1.28%、1.74%和0.15%,均在1.80%以下。286份牦牛粪便样品中，采用建立的实时荧光定量PCR检测方法检出BEV阳性样品182份，阳性率为63.64%;采用普通RT-PCR方法检出BEV阳性样品114份，阳性率为39.86%;两种方法的符合率为76.22%。说明本研究建立的牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好，可用于牦牛腹泻临床样本的BEV检测。
关键词：牦牛;;牛肠道病毒;;3D基因;;腹泻;;检测方法;;实时荧光定量PCR
基金资助：国家重点研发计划项目(2022YFD1602312);; 青海省科技厅项目(2022-NK-118);; 青海大学青年科研基金项目(2021-QNY-5)
