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作者：倪英群;杨矛;杨迪;郭呈林;朱文君;俞雅琴;卢芹;骆金芝;吴春琴;方朝晖;
单位：安徽中医药大学第一附属医院内分泌科;安徽省中医药科学院中医药防治糖尿病研究所;安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室;安徽中医药大学研究生院;
摘要：目的：采用mRNA高通量测序技术筛选高磷诱导下肢血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化差异表达基因（DEGs），分析VSMCs钙化的关键基因及信号通路。方法：将人VSMCs分为对照组和模型组，模型组细胞中加入高磷培养基，对照组细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基于相同条件下培养。调整2组稳定转染VSMCs的状态，培养12 d，倒置显微镜下观察细胞形态表现并拍照。采用Hisat2软件筛选DEGs，采用Stringtie软件从生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）3个方面进行基因本体论（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。Von Kossa染色法观察各组细胞钙化情况，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组细胞中碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2(BMP2)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、肿瘤蛋白53(Tp53)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁蛋白轻链1(Ftl1)和糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1(GPLD1)mRNA表达水平。结果：与对照组比较，模型组共2 524个DEGs，其中1 368个DEGs表达上调，1 156个DEGs表达下调；2组细胞DEGs聚类分离明显。GO功能和KEGG信号通路富集分析表达上调的DEGs主要参与微管细胞骨架组织的调节、细胞极性、蛋白质定位和细胞周期调控等BP，构建细胞膜部分、微管组织、染色体和着丝粒区等CC，发挥与磷脂酰肌醇磷酸盐、 Rho鸟苷酸三磷酸酶（GTPase）蛋白结合、参与跨膜转运和调节蛋白激酶活性等MF；表达下调的DEGs主要参与细胞质翻译、蛋白质膜定位、mRNA代谢和蛋白质内质网定位等BP，构建核糖体亚单位、细胞膜和自噬体等CC，发挥与单链DNA、核糖核蛋白复合物、生长因子结合、调节蛋白激酶活性和催化作用等MF。差异表达上调的基因富集7条信号通路，其中最为显著的是糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的生物合成；差异表达下调的基因富集18条信号通路，其中最为显著的是铁死亡。RT-qPCR法，与对照组比较，模型组细胞中GPX4、Ftl1和Tp53 mRNA表达水平明显降低（P<0.01）,GPLD1 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）；与对照组比较，模型组细胞中α-SMA mRNA表达水平明显降低（P<0.01）,ALP和BMP2 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。结论：钙化的VSMCs与正常细胞存在DEGs，铁死亡和GPI锚定的生物合成信号途径是高磷诱导下肢VSMCs钙化的关键信号通路，主要由GPX4、Ftl1、Tp53和GPLD1共同介导完成。
关键词：血管平滑肌细胞;;成骨分化;;细胞钙化;;mRNA测序;;铁死亡
基金资助：国家自然科学基金项目（82274468）;; 安徽省教育厅高校优秀人才支持计划项目（gxyqZD2021114）;; 安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室开放项目（2022XAYX06）;安徽中医药大学临床科研项目（2021yfylc07）
