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作者：何嘉文;李友;廖科棋;李胜男;
单位：广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室;广东医科大学附属医院神经病学研究所;
摘要：目的：构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体，建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法：通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库检索EIF4A3基因序列，设计并合成PCR鉴定引物，并将其连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒GV493载体，构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒质粒，PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493空载质粒和GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒分别转染至HEK293T细胞中，分别为GV493对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒，转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为空白组、GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组，空白组不作处理，GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组分别采用相应慢病毒感染Neuro-2a细胞，慢病毒感染复数（MOI）为100，使用10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的Neuro-2a细胞，荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞的生长状态和绿色荧光表达情况；实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中EIF4A3 mRNA及蛋白表达水平。结果：PCR测序结果显示GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒基因序列与设计合成的EIF4A3-shRNA序列一致，成功构建GV493-EIF4A3慢病毒载体。荧光显微镜观察可见HEK293T细胞荧光表达强烈，生长状态良好，慢病毒包装成功。GV493-对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒的滴度均为2×10~8 TU·mL~(-1),GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光，表明慢病毒感染稳定细胞系构建成功。RT-qPCR法，与空白组和GV493对照组比较，GV493-EIF4A3shRNA组Neuro-2a细胞EIF4A3mRNA表达水平明显降低（P<0.01）。Western blotting法，各组在相对分子质量49 000处出现特异性条带，提示Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达成功；与空白组和GV493对照组比较，GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。结论：成功构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒载体，建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系，为EIF4A3在颅内动脉粥样硬化的作用机制研究提供了参考。
关键词：真核细胞翻译起始因子4A3;;短发夹RNA;;慢病毒;;稳定转染细胞系;;Neuro-2a细胞
基金资助：国家自然科学基金项目（81571157）;; 广东省卫生厅医学科研基金项目（A2022139,A2023193）;; 湛江市科学技术局科技攻关计划项目（2021B01370）
