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作者：王腾飞;陈凤;齐玲;雷婷;宋美慧;
单位：大理大学药学院;广州医科大学附属清远医院广东省清远市人民医院;
摘要：目的：探讨D-柠檬烯对胶质母细胞瘤（GBM）细胞增殖和凋亡的影响，并阐明其可能的作用机制。方法：将GBM细胞分为对照组（0 mmol·L~(-1)D-柠檬烯）和0.2、 0.4、 0.6、 0.8及1.0 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组。采用CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率，克隆形成法检测各组细胞克隆形成率，AnnexinⅤ-FITC/PI法检测各组细胞凋亡率，Western blotting法检测各组细胞中蛋白激酶B(AKT)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和多聚二磷酸腺苷（ADP）核糖聚合酶（PARP）蛋白表达水平，免疫荧光法检测各组细胞中裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cleaved Caspase）-3蛋白表达水平。15只建立皮下移植瘤模型小鼠随机分为空白组（0 mg·kg~(-1)·d~(-1) D-柠檬烯）、低剂量D-柠檬烯组（200 mg·kg~(-1)·d~(-1)D-柠檬烯）和高剂量D-柠檬烯组（400 mg·kg~(-1)·d~(-1)D-柠檬烯），每组5只。计算各组小鼠体内肿瘤抑制率，HE染色和免疫组织化学染色观察各组小鼠皮下肿瘤组织形态表现，并绘制肿瘤生长曲线，免疫组织化学法检测各组小鼠皮下瘤组织中Ki67蛋白阳性表达率，TUNEL染色法检测各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况。结果：对照组细胞呈长梭形，状态良好，紧密且贴壁生长，细胞器和细胞质正常；给药48 h后，0.6 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组细胞体积减小，细胞膜虽完整但通透性增强，细胞质皱缩，细胞内部产生空泡结构，部分呈碎片状漂浮在溶液表面；0.8和1.0 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组细胞中有明显凋亡小体生成，呈现凋亡状态。CCK-8法，与对照组比较，0.6、0.8和1.0 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组U87、 LN229及GL261细胞增殖抑制率均明显升高（P<0.01）,0.4 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组U87和GL261细胞增殖抑制率均明显升高（P<0.01）。克隆形成法，与对照组比较，0.4、0.6和0.8 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组U87、LN229及GL261细胞克隆形成率均明显降低（P<0.05或P<0.01）。AnnexinⅤ-FITC/PI法，与对照组比较，D-柠檬烯处理48 h后，0.6、0.8和1.0 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组LN229细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。Western blotting法，与对照组比较，0.6、0.8和1.0 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组LN229细胞中Bax蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）,AKT和Bcl-2蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）;0.8和1.0 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组LN229细胞中PARP蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。免疫荧光法，与对照组比较，0.6、0.8和1.0 mmol·L~(-1) D-柠檬烯组LN229细胞中cleaved Caspase-3蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。与空白组比较，低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤体积均明显减小（P<0.01）。与空白组比较，低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤质量均明显降低（P<0.05），肿瘤抑制率均明显升高（P<0.05）。空白组小鼠肿瘤细胞弥漫分布，细胞核染色加深，核浆比增大；低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤组织出现大量肿瘤细胞变性坏死。与空白组比较，低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤组织中Ki67蛋白阳性表达率均明显降低（P<0.01）。与空白组比较，低和高剂量D-柠檬烯组小鼠肿瘤细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）。结论：D-柠檬烯具有抑制GBM细胞增殖的作用，其作用机制可能与调控AKT蛋白的表达并激活Caspase-3通路诱导凋亡有关。
关键词：D-柠檬烯;;胶质母细胞瘤;;细胞凋亡;;移植瘤;;蛋白激酶B
基金资助：国家自然科学基金项目（82203351,82160662）;; 广东省基础研究委员会基础与应用基础研究基金项目（2021A1515111095,2021A1515010716）;; 广东省清远市人民医院医学科研基金（20220330）
